关于革兰氏染色液试剂盒体外诊断试剂的使用注意事项有哪些地方？

 

　　革兰氏染色液试剂盒体外诊断试剂盒是于1884年所发明，是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，是一种复染法。未经染色之细菌，由于其与周围环境折光率差别甚小，故在显微镜下极难观察。染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，而用以分类鉴定。通过此法染色，可将细菌鉴别为革兰阳性菌（G+）和革兰阴性菌（G-）两大类。

 

　　细菌的不同显色反应是由于细胞壁对乙醇的通透性和抗脱色能力的差异，主要是肽聚糖层厚度和结构决定的。经结晶紫染色的细胞用碘液处理后形成不溶性复合物，乙醇能使它脱色。在革兰阴性细胞染色中，乙醇或丙酮破坏了胞壁外膜、损伤肽聚糖层和细胞质膜，结晶紫和碘的复合物从细胞中渗漏出来，当再用其他染色液复染时，显现红色。红色染料虽然也能进入已染成紫色的G+细胞，但被紫色盖没，所以红色显示不出来。在革兰阳性细胞染色中，乙醇还能使厚的肽聚糖层脱水，导致孔隙变小，由于结晶紫和碘的复合物分子太大，不能通过细胞壁，不易脱色，所以保持着紫色。

 

　　革兰氏染色液试剂盒体外诊断试剂操作步骤（仅供参考）：

 

　　1、涂片：取待检细菌，于载玻片中央涂成薄层或者或在载玻片上滴加少许无菌水，取菌与的水混合均匀，涂成一薄层。

 

　　2、干燥：涂片后在室温下自然干燥，也可在酒精灯上略加温，使之迅速干燥。

 

　　3、固定：手持载玻片一端，标本面朝上，在酒精灯的火焰外侧快速来回移动3~5次，每次1s，温度不宜过高，防止菌体蛋白变性，放置待凉后染色。也可以用甲醇或乙醇固定。

 

　　4、初染：滴加结晶紫染色液染色1~2min，清水冲洗去染色液。

 

　　5、媒染：滴加Gram碘液，并覆盖载玻片，室温放置1~2min，水洗。

 

　　6、脱色：滴加脱色液，摇动10～30s，直至流下的脱色液不出现紫色时为止，立即用水冲去脱色液，终止反应。

 

　　7、复染：滴加沙黄染色液染色30s~1min，水洗。

 

　　8、干燥。

 

　　9、镜检：置油镜观察。

 

　　革兰氏染色液试剂盒体外诊断试剂盒注意事项：

 

　　1、涂片之前，应事先在背面做好圆圈标记，以便判断后续试验的位置。

 

　　2、取细菌时，应注意自我防护，拔或塞试管塞时，应将试管口通过火焰略加烧灼，zui后将接种环在火焰上烧灼灭菌。

 

　　3、加热固定涂片时，应注意玻片勿太靠近火焰，一般要求玻片温度不超过60℃，以玻片背面触及手背皮肤不觉过烫为宜。

 

　　4、革兰氏染色的关键在于严格掌握脱色程度，脱色时间应根据经验判断。脱色过度，阳性菌可被误染为阴性菌；脱色不够，阴性菌可被误染为阳性菌。

 

　　5、待检细菌培养时间也会影响染色效果，阳性菌培养时间过长或已死亡或细菌溶解，都常呈阴性反应。

 

　　6、上述试剂均对人体有刺激性，请注意适当防护。

 

　　在我国，苏木素伊红染色液试剂盒体外诊断试剂是指：可单独使用或与仪器、器具、设备或系统组合使用, 在疾病的预防、诊断、治疗监测、预后观察、健康状态评价以及遗传性疾病的预测过程中, 用于对人体样本( 各种体液、细胞、组织样本等) 进行体外检测的试剂、试剂盒、校准品( 物) 、质控品( 物)等。

 

　　随着我国临床诊断需求的不断增长，以及研发技术的不断提高，体外诊断(IVD)行业已经成为我国医药行业中发展zui快，也zui活跃的细分行业之一。虽然目前我国体外诊断行业尚处于发展初期，但其发展一直受国家产业政策重点支持。将体外诊断试剂、诊断仪器、诊断相关酶制剂等产业的发展列为重点发展项目，将体外诊断列为战略性新兴产业。

 

　　苏木素伊红染色液试剂盒体外诊断试剂断行业包括仪器、试剂和耗材，其中IVD市场80%是试剂，本报告以诊断试剂为主，兼顾部分耗材情况，较少讨论诊断仪器。

 

　　苏木素伊红染色液试剂盒体外诊断试剂是一种碱性染料，同媒染剂（常用的是三价的铁或铝的盐）一起使用，能够使细胞核染色。苏木素和氧化苏木素都没有染色能力，但与媒染剂结合形成色淀（lake），这种色淀具有染色能力。核、染色体、着丝粒、中心体、线粒体、髓鞘等可被染成蓝色以至黑色。与伊红合用的苏木素-伊红双重染色法是zui基本的一般组织的染色法，苏木素染色原理如下：

 

　　苏木素和伊红在组织学上被经常使用，碘液不同，这是一种染色街。其他常用的含有苏木素的染色剂有磷钨酸苏木素染色剂，也就是磷钨酸与苏木素的混合物。苏木素染色剂经常为组织的研究使用。明矾和三价铁盐常常被用作媒染剂，展示核和细胞质结构。这些媒染剂的原理都是形成媒染剂－染料－组织复合体，从而显示颜色。

 

　　苏木素染色内质呈淡蓝黑色，外质收缩，剩下部分不着色或色泽更浅。圆形细胞核呈蓝黑色。居中的核仁呈黑色小圆点。核膜较薄，其内侧缘均匀，整齐地排列着一层细小的染色质粒。核仁与核膜之间可见到核网。被吞噬的红细胞呈蓝黑色采用苏木素染色液进行免疫染色后的复染，操作步骤简便，操作时间短。可以操作步骤简便，操作时间短或培养细胞的染色，或与免疫组织化学、免疫细胞化学、免疫荧光、原位杂交等配合使用。使用苏木素染色液染色后还可以进行免疫染色或其它染料的复染。

 

　　1、血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

 

　　2、人凝血因子Ⅲelisa试剂盒血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

 

　　3、尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

 

　　4、细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

 

　　5、组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。

 

　　6、标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融.

 

　　7、不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

 

　　苏木素伊红染色液试剂盒体外诊断试剂操作步骤：

 

　　1、标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在*、第二孔中分别加标准品100μl，然后在*、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从*孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。

 

　　2、人凝血因子Ⅲelisa试剂盒加样：分别设空白孔、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

 

　　3、温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

 

　　4、配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。

 

　　5、洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

 

　　6、加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

 

　　7、温育：操作同3。

 

　　8、洗涤：操作同5。

 

　　9、显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.

 

　　10、终止：每孔加终止液50μl，终止反应。

 

　　11、苏木素伊红染色液试剂盒体外诊断试剂盒测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值），测定应在加终止液后15分钟以内进行。

 

　　OPD（邻苯二胺）底物显色一般在室外温或37℃反应20-30分钟后即不再加深，再延长反应时间，可使本底值增高。OPD底物液受光照会自行变色，显色反应应避光进行，显色反应结束时加入终止液终止反应。OPD产物用硫酸终止后，显色由橙黄色转向棕黄色。

 

　　TMB（四甲基联苯胺）受光照的影响不大，可在室温中置于操作台上，边反应观察结果。但为保证实验结果的稳定性，宜在规定的适当时间阅读结果。TMB经HRP作用后，约40分钟显色达，随即逐渐减弱，至2小时后即可*消退至无色。TMB的终止液有多种，叠氮钠和十二烷基硫酸钠（SDS）等酶抑制剂均可使反应终止。这类终止剂尚能使蓝色维持较长时间（12-24小时）不褪，是目视判断的良好终止剂。此外，各类酸性终止液则会使蓝色转变成黄色，此时可用特定的波长（450nm）测读吸光值。

 

　　比色

 

　　比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比色仪的比色架中。以软板为载体的试验，需先将板置于标准96孔的座架中，才可进行比色。在加底物液显色前，先将软板边缘剪净，这样，此板就可*平妥坐入座架中。

 

　　比色时应先以蒸馏水校零点，测读底物孔（未经任何反应仅加底物液的孔）和空白孔（以生理盐水或稀释液代替标本作全过程的孔），以记录本次试验的试剂状况。其后可用空白孔以蒸馏水校零点，以上各孔的吸光度需减去空白孔的吸光度，然后进行计算。

 

　　酶标比色仪简称酶标仪，通常指于测读全组织细胞色素C氧化酶活性染色试剂盒结果吸光度的光度计。针对固相载体形式的不同，各有特制的适用于板、珠和小试管的设计。许多试剂公司配套供应酶标仪。酶标仪的主要性能指标有：测读速度、读数的准确性、重复性、度和可测范围、线性等等。优良的酶标仪的读数一般可到0.001，准确性为±1%，重复性达0.5%。举例说，若某孔测得的A值为1.083，则该孔相对于空气的真实A值应为1.083±0.01(1.073～1.093)，重复测定数次，其A值均应1.083±0.05（1.078～1.088）在之间。酶标仪的可测范围视各全组织细胞色素C氧化酶活性染色试剂盒的性能而不同。普通的酶标仪在0.000～2.000，新型号的酶标仪上限拓宽达2.900，甚至更高。超出可测上限的A值常以“*”或“over”或其它符号表示。应注意可测范围与线性范围的不同，线性范围常小于可测范围，比如某一酶标仪的可测范围为0.000～2.900，而其线性范围仅0.000～2.000，这在定量ELISA中制作标准曲线时应予注意。

 

　　酶标仪不应安置在阳光或强光照射下，操作时室温宜在15-30℃，使用前先预热仪器15-30分钟，测读结果更稳定。

 

　　冰冻切片细胞色素C氧化酶活性染色试剂盒操作体会：

 

　　1. 控制好染色步骤；

 

　　2. 组织固定起着很重要的作用，根据不同的固定溶液可延长或缩短染色时间；0.2%冰醋酸水溶溶液洗，可使色调清晰鲜艳；

 

　　3. 磷钼酸水溶溶液对丽春红、酸性复红有分化作用，分化时镜下控制， 肌纤维和纤维素呈红色，胶原纤维呈淡粉红色即可。

 

　　冰冻切片细胞色素C氧化酶活性染色试剂盒广泛存在于动物、和植物中，催化葡萄糖氧化生成葡萄糖酸，并产生H2O2，是生物体中产生活性氧的代谢途径之一。

 

　　测定原理：GOD催化产生H2O2，过氧化物酶在有氧存在时催化H2O2分解产生的氧又将邻联茴香胺氧化生成有色物质，颜色深浅与葡萄糖氧化酶活性成线性关系。

 

　　是人体内zui普遍的、不可缺乏的条件性必需氨基酸，是构成蛋白质*的氨基酸之一，更是某些细胞培养中zui基本的元素。由于谷氨酰胺不稳定的特性，在细胞培养基的整合中，易自发性分解为谷氨酸和氨离子，而氨离子对细胞的毒性很强，因此，在细胞培养体系中，须密切关注谷氨酰胺的储存寿命（SHELF LIFE）和实时监测。在谷氨酰胺酶和谷氨酸脱氢酶的双酶循环反应系统中，L-谷氨酰胺首先发生脱氨基反应，产生谷氨酸和氨离子；进一步氨与2-酮戊二酸反应再次产生谷氨酸，同时将还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸即测定NADPH（340nm  波长）的浓度变化

 

　　冰冻切片细胞色素C氧化酶活性染色试剂盒样品收集、处理及保存方法

 

　　1. 血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000 转离心10 分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。

 

　　2. 血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000 转离心30 分钟取上清。

 

　　3. 细胞上清液：3000 转离心10 分钟去除颗粒和聚合物。

 

　　4. 组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000 转离心10 分钟取上清。

 

　　5. 保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

 

　　自备物品

 

　　15毫升锥形离心管：用于制备样品的容器

 

　　比色皿：用于比色的容器

 

　　96孔酶标板：用于比色的容器

 

　　分光光度仪：用于比色分析

 

　　酶标仪：用于微量样品比色分析