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DNA损伤测试盒中文版说明书
点击次数:311 发布时间:2017-12-28

DNA损伤测试盒中文版说明书

(货号:MB1189  彗星法)

一、测定意义:

DNA在自由基(如·OH)的攻击下容易发生损伤,即脱氧戊糖遭到破环,磷酸二脂键的断裂,碱基的破环或脱落,便可进一步产生单链断裂或双链断裂。将细胞固定于低熔点琼脂糖中,取少量细胞涂在载玻片上,用碱高盐溶液破坏细胞膜,再用碱溶液使DNA分子解旋。将载玻片置于电泳液中,在电场的作用下,DNA分子向阳极移动。如果DNA损伤严重,碎片多,则电泳速度快。未受损伤的DNA大分子则由于细胞膜的阻隔,滞留在原处。用PI染色或银染,可观察到DNA受损的细胞形同彗星现象,作定性分析。也可用相关的软件作定量分析。

二、试剂盒组份:

组份

20T

储存条件

Lysis Bufffer

100ml

4℃保存

DMSO

8ml

4℃保存

正常熔点琼脂糖 NMA

30mg

4℃保存

低熔点琼脂糖 LMA

30mg

4℃保存

Propidium Iodide (PI)

400μl

4℃避光保存

三、所需仪器及自备试剂:

低速离心机、水平电泳仪、荧光显微镜、37℃和45℃恒温水浴箱、载玻片、盖玻片、平皿、微量移液器、1.5ml Microtube、0.4mmol/L Tris-HCl(pH7.5)缓冲液、PBS

四、注意事项:Propidium Iodide(PI)和EB有毒,操作时要戴手套。

五、操作步骤:

   1、细胞用冰冷的PBS洗一次,离心收集,用PBS重悬使其密度为1x106个/ml;

   2、铺胶:下述各浓度琼脂糖凝胶均用PBS配制,

      第1层凝胶的制备:将载玻片的磨砂面向上,45℃预热,将预热45℃的100μl的0.5%正常熔点琼脂糖(NMA)铺于载玻片上,盖上干净的盖玻片,再置4℃下10min使NMA凝固。

第2层凝胶的制备:将10μl细胞(约104个)和75μl的0.7%低溶点琼脂糖LMA(在37℃下水浴加热至少20min使之完全溶化)混合均匀。然后,轻轻揭去盖玻片,迅速将含细胞的LMA滴到第1层琼脂糖上,立即盖上另一干净盖玻片,置4℃10min使第2层LMA凝固。

第3层凝胶的制备:第2层LMA凝固后,在室温下小心移去盖玻片,滴加预热37℃的75μl的0.7%低溶点琼脂糖LMA,如上盖上盖玻片4℃下凝固(第三层覆盖第二层周围0.5mm,增加凝胶化作用时间至30min,高湿度环境)。

3、细胞裂解:移去盖玻片,将玻片置于平皿中,倒入预冷的Lysis Bufffer(使用前每9ml加入1ml的DMSO),4℃裂解1~2h,取出载玻片用PBS漂洗。

4、DNA碱解旋:将载玻片置于水平电泳槽。倒入新配制的碱性电泳缓冲液(用户自备1mmol/L EDTA,300mmol/L NaOH),约覆过载玻片胶面0.25cm左右,室温放置20~60min,以便使DNA在碱性条件下解螺旋和产生碱易变性区段,使DNA断链在电场中易于迁移。

5、单细胞电泳:在电压25V,电泳20~30min,电压、电流可用改变缓冲液面高低来调节。

6、中和与染色:电泳后将载玻片置于平皿内。加入0.4mmol/L Tris-HCl(ph7.5)缓冲液,将载玻片没入,4℃中和三次,每次10min,弃去Tris-HCl缓冲液,每载玻片加20μl的PI染液或EB染液,盖上盖玻片,避光染色10min。

7、观察、拍照和分析:荧光显微镜515~560nm波长的激发光、PI染色的DNA图象呈红色,EB染色的DNA图象呈桔红色,可清楚地观察到核DNA和迁移的DNA(即慧星尾)。每个样本随机选择100个细胞,测定核DNA直径和DNA迁移的长度,可并用相应的软件分析。

DNA损伤按慧星尾部DNA量占全部DNA量的比例分为5级:

0级:        < 5%             无损伤;

1级:       5 ~20%          轻度损伤;

2级:       20~40%          中度损伤;

3级:       40~95%          高度损伤;

4级:       > 95%           重度损伤。

 

 

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