植物细胞氧化应激活性氧羟自由基原位荧光染色试剂盒产品说明书（中文版）

 植物细胞氧化应激活性氧羟自由基原位荧光染色试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

 植物细胞氧化应激活性氧羟自由基原位荧光染色试剂是一种旨在通过透膜荧光染色剂羟苯基荧光素，与细胞内羟自由基的反应，产生绿色荧光，来测定细胞内羟自由基活性氧族的生成和增加的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。可以被用于细胞凋亡、信号传递、衰老、代谢等的研究。其适用于各种新鲜植物组织（例如根尖、叶片等）和培养细胞等细胞内氧化应激活性氧羟自由基的分析。产品严格无菌，即到即用，操作简易，活体检测，性能稳定，荧光清晰。

技术背景

超氧自由基阴离子（superoxide radical；O2^-）、过氧化氢（hydrogen peroxide；H2O2）、羟自由基或氢氧基（hydroxyl radical；OH^-）、过氧化基（peroxyl radical；ROO^-）、氢过氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO^-）、过氧亚硝基阴离子（peroxynitrite anion；ONOO^-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、单线态氧气（singlet oxygen）等细胞内活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的产生和增多，将导致细胞衰老或凋亡。其中羟自由基或氢氧基具有极度反应性和毒性，同时半衰期短（10^－9至10^－10秒）。其产生主要是水分子受到高能量放射后裂解、过氧化物和次氯酸反应、过氧化氢的还原、超氧化物的歧化等形成。在植物组织中，羟自由基将启动放射性诱导损伤、攻击植物蛋白和膜脂而引起氧化损伤。羟苯基荧光素（Hydroxyphenyl fluorescein；2-[6-(4’-Hydroxy)phenoxy-3H-xanthen-3-on-9-yl]benzoic acid；HPF）是一种*自由通过细胞膜的染色剂，一旦与羟自由基反应，产生脱苄基（o-dearylation）作用，生成强烈荧光的荧光素（fluorescein）。据此证明植物细胞内羟自由基活性氧族的存在。

产品内容

 清理液（Reagent A） 100毫升

 固着液（Reagent B）  50毫升

 离析液（Reagent C）  20毫升

 染色液（Reagent D） 100微升

产品说明书   1份

保存方式

保存 染色液（Reagent D）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里； 固着液（Reagent B）和 离析液（Reagent C）具有腐蚀性，注意操作安全；有效保证6月

用户自备

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（GMS12024）：用于细胞脱离

*细胞培养液（GMS12052）：用于细胞操作所需的培养基

15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器

1.5毫升离心管：用于染色液配制的容器

2毫升离心管：用于样品操作的容器

载玻片：用于组织染色操作

解剖针：用于植物组织解剖

血细胞计数仪：用于细胞计数

（微型）台式离心机：用于样品处理

培养箱：用于染色孵育

比色皿或黑色96孔板：用于荧光定量分析的容器

（共聚焦）荧光显微镜：用于荧光分析

细胞流式仪：用于细胞染色分析

荧光分光光度仪或荧光酶标仪：用于荧光定量分析

实验步骤

方法一：活体组织染色

• 加上100微升 清理液（Reagent A）在载玻片上
• 切取新鲜植物根尖，放进载玻片上的 清理液（Reagent A）中
• 用解剖针小心压碎根尖
• 小心移去 清理液（Reagent A）
• 小心加上1毫升 清理液（Reagent A）在根尖上
• 再加上5微升 染色液（Reagent D） 
• 放进37℃培养箱里孵育30分钟
• 取出载玻片，移去染色液
• 小心加上1毫升 清理液（Reagent A）
• 小心移去 清理液（Reagent A）
• 盖上盖玻片，用拇指小心且垂直加压
• 即刻在（共聚焦）荧光显微镜下进行观察：激发波长499nm，散发波长515nm——绿色荧光增强，表明羟自由基含量高 

方法二：组织固定染色

• 加上100微升 清理液（Reagent A）在载玻片上
• 切取新鲜植物根尖，放进载玻片上的 清理液（Reagent A）中
• 用解剖针小心压碎根尖
• 小心移去 清理液（Reagent A）
• 小心加上2毫升 固着液（Reagent B）
• 室温下，孵育3小时，避免干化
• 小心移去 固着液（Reagent B）
• 小心加上1毫升 清理液（Reagent A）
• 小心移去 清理液（Reagent A）
• 小心加上1毫升 离析液（Reagent C）
• 室温下孵育5分钟
• 小心移去 离析液（Reagent C）
• 小心加上1毫升 清理液（Reagent A）
• 小心移去 清理液（Reagent A）

• 小心加上1毫升 清理液（Reagent A）在根尖上
• 再加上5微升 染色液（Reagent D） 
• 放进37℃培养箱里孵育30分钟
• 取出载玻片，移去染色液
• 小心加上1毫升 清理液（Reagent A）
• 小心移去 清理液（Reagent A）
• 盖上盖玻片，用拇指小心且垂直加压
• 即刻在（共聚焦）荧光显微镜下进行观察：激发波长499nm，散发波长515nm——绿色荧光增强，表明羟自由基含量高

方法三、培养植物细胞脱离染色

• 准备1瓶25cm²细胞培养瓶的待测细胞
• 小心抽去细胞培养液
• 加入3毫升  清理液（Reagent A）到细胞培养瓶，覆盖培养瓶表面
• 小心抽去 清理液（Reagent A）
• 加入1毫升用户自备的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，铺满整个培养平面
• 置入37℃培养箱1分种
• 振动培养瓶，使细胞脱落
• 加入4毫升用户自备的*细胞培养液
• 移入15毫升锥形离心管，充分混匀（注意：悬浮细胞直接从这一步骤开始）
• 移取10微升在血细胞计数仪上进行细胞计数
• 移出1 X 10⁶细胞到新的15毫升锥形离心管
• 放进台式离心机离心5分钟，速度为300g
• 小心抽去上清液
• 加入1毫升 清理液（Reagent A）
• 再加入5微升 染色液（Reagent D），混匀
• 放进37℃恒温水槽孵育30分钟，避免光照
• 放进台式离心机离心5分钟，速度为300g
• 小心抽去上清液
• 加入预冷的400微升 清理液（Reagent A），轻柔混匀细胞颗粒群
• 放进冰槽里
• 选择下列方式之一进行操作：
  • 即刻进行细胞流式仪分析：波长488nm氩离子激光，观察50000个细胞以上――

波峰右移，表明羟自由基含量高

• 或使用（共聚焦）荧光显微镜观察（定性检测）：

1）移取10微升上述细胞悬液到载波片上，盖上盖玻片

2）激发波长499nm，散发波长515nm――

绿色荧光增强，表明羟自由基含量高

• 或使用荧光分光光度仪检测（定量检测）：

1）移取400微升上述细胞悬液到1毫升比色皿

2）加入600微升 清理液（Reagent A）

3）上下倾倒混匀数次

4）放进荧光分光光度仪：激发波长499nm，散发波长515nm――

RFU增高，表明羟自由基含量高

方法四、贴壁培养细胞染色

• 准备1个细胞培养24孔板的待测细胞，细胞铺满率达70％

（注意：可以使用载玻片，载玻片培养皿，35mm培养皿，和其它培养孔板，见注意事项4）

• 小心抽去细胞培养液
• 小心沿着孔壁加入500微升 清理液（Reagent A）到1个细胞培养孔，覆盖培养孔表面
• 再加入2.5微升 染色液（Reagent D）
• 放进37℃细胞培养箱里孵育30分钟
• 小心抽去染色液 
• 小心沿着孔壁加入500微升37℃预热的 清理液（Reagent A）到细胞培养孔
• 选择下列方式之一进行操作：

（A） 使用倒置荧光显微镜观察（定性检测）：

激发波长499nm，散发波长515nm――绿色荧光增强，表明羟自由基含量高

•  使用荧光酶标仪检测（定量检测）：

激发波长499nm，散发波长515nm――RFU增高，表明羟自由基含量高

方法五、组织匀浆定量检测

• 准备好新鲜的植物组织（叶片、谷粒、种子等），并秤重以确定100毫克组织重量 
• （选择步骤）放进预冷的15毫升锥形离心管
• （选择步骤）加入2毫升 清理液（Reagent A）清洗1次
• 即刻用刀片切碎组织
• 放进一个预冷的15毫升锥形离心管
• 加入预冷的2毫升 清理液（Reagent A）
• 涡旋震荡5秒，充分混匀
• 即刻放进预冷的DOUNCE匀浆器，在冰槽里用研磨棒匀化组织（约80下）
• 将所有组织匀浆物移入2毫升离心管，放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为5000g（或7500RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移出上清液（注意：不要触碰沉淀物）到另一个新的预冷的2毫升离心管
• （选择步骤）如果上清液含有肉眼可见的残渣，重复离心5分钟一次，速度为5000g（或7500RPM，例如eppendorf 5415）
• （选择步骤）即刻移入到2毫升离心管
• 移取5微升组织匀浆物进行蛋白定量检测：建议使用  Bradford蛋白质浓度定量试剂盒（GMS30030.1）
• 移取50微升组织匀浆物（样品：100微克蛋白）或50微升 清理液（Reagent A）（背景对照）到1毫升比色杯里
• 加入950微升 清理液（Reagent A）
• 再加上5微升 染色液（Reagent D）
• 上下倾倒混匀
• 放进37℃恒温水槽孵育30分钟，避免光照
• 即刻放进荧光分光光度仪检测：激发波长499nm，散发波长515nm——（样品RFU-背景对照RFU）＝实际RFU：增加，表明羟自由基含量高

注意事项

• 本产品为20次操作
• 操作时，须戴手套
•  固着液（Reagent B）和 离析液（Reagent C）具有腐蚀性，注意操作安全
• 孵育时，必须避免光照
• 建议染色完成后，即刻进行荧光检测分析
• 本产品适合各种规格的培养细胞：载玻片，载玻片培养皿，35mm培养皿，和各种培养孔板，须相应调整操作用量：

• 本产品适合活体染色和固定染色；建议活体染色为佳
• 如果羟自由基浓度过低，可以延长孵育时间至60分钟
• 根据不同组织类型，调整 染色液（Reagent D）的使用剂量（1：20至1：1000容量比），避免过度染色
• 激发波长可以选择在485至500nm，散发波长505至550nm之间的任一波长
• 本公司提供系列活性氧分析试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定荧光清晰