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钙离子膜通道钠钙交换体(NCX/内质网)试剂盒产品说明书
点击次数:486 发布时间:2017-03-21

钙离子膜通道钠钙交换体NCX/内质网)功能荧光检测试剂盒产品说明书

(中文版)

 

主要用途

 

 钙离子膜通道钠钙交换体NCX/内质网)功能荧光检测试剂是一种旨在使用选择性内质网型钙ATP酶、钠钾ATP酶和线粒体钙泵抑制剂的条件下,通过钙离子荧光探针,探测在ATP的激发下,进入内质网内的钙离子,而产生荧光增强,来分析和观察内质网钠钙交换体转运功能的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种动物、人体、真菌/酵母、植物等内质网钠钙交换体活性的检测,以及抑制剂筛选。产品严格无菌,即到即用,操作简捷,性能稳定。

 

技术背景

 

钠钙交换体(sodium-calcium exchanger;Na+-Ca++ exchanger;NCX)是一种反向协同膜蛋白(antiporter membrane protein),常见于兴奋细胞的细胞膜上和线粒体或内置网上,使钙离子排出胞浆外或进入细胞器,通过移除1分子钙离子,交换进入3分子钠离子,达到细胞钙离子微环境稳态平衡,以控制神经分泌、光敏受体活性、心肌松弛、以及兴奋-收缩偶联等功能。钠钙交换体和钙ATP酶不同,其与钙离子的亲和力低。钠钙交换体有5种异构体:NCX1、NCX2、NCX3、NCX-SQ1、CALX。钠钙交换体异常与心肌缺血-再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury)有关。KB R7943、SEA0400和SN-6等是钠钙交换体选择性抑制剂,具有治疗心肌缺血、心律失常、心衰和高血压的药理价值。Mag-Fluo--AM染料是一种钙离子低亲和性的荧光标记染料,特异性地由内质网捕获,可以检测内质网内的游离钙离子浓度的变化,进而分析内质网钠钙交换体的作用模式,监测镁ATP诱导的钙离子摄入,来评价钠钙交换体的功能。其基本检测步骤是,首先引入荧光探针到内质网,其次膜通透处理后,同步加入线粒体钙泵抑制剂FCCP、内质网型钙ATP酶抑制剂毒胡萝卜素(thapsigargin;TG)、钠钾ATP酶抑制剂乌本苷(ouabain)和Mg-ATP,在荧光分光光度仪下(激发波长490nm,散发波长525nm)观察荧光峰值的变化。 

 

产品内容

 

 清理液(Reagent A) 100毫升

 染色液A(Reagent B1)  10毫升

 染色液B(Reagent B2) 100微升

 通透液(Reagent C) 200微升

 钙化液(Reagent D)  20毫升

 摄钙液(Reagent E) 100微升

 诱导液(Reagent F) 200微升

产品说明书   1份

 

保存方式

 

保存 清理液(Reagent A)在4冰箱里,其余的保存在-20冰箱里,避免反复冻融; 染色液B(Reagent B2)避免光照;有效保证6月

 

用户自备

 

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液(  12024):用于细胞脱离

完全细胞培养液(  12052):用于细胞处理所需的培养基

15毫升锥形离心管:用于样品操作的容器

1.5毫升离心管:用于样品操作的容器

微型台式离心机:用于样品操作

恒温水槽或培养箱:用于反应孵育

100微升比色皿或黑色96孔板:用于荧光分析的容器

荧光分光光度仪或荧光酶标仪:用于荧光定量分析

 

实验步骤

 

  • 测定准备

 

  • 开启并设定好荧光分光光度仪或荧光酶标仪(温度为22℃):激发波长为490nm,散发波长525nm,间隔30秒测读1次,或动态测读,并置零
  • 实验开始前,将-20℃冰箱里的试剂盒中的试剂置于室温下冻融预热,避免光照。然后进行下列操作

 

  • 荧光测定

 

  • 间接法

 

  • 准备1个25cm2细胞培养瓶的待测细胞,铺满率达70%(1 X 106细胞数)
  • 小心抽去细胞培养液
  • 加入3毫升  清理液(Reagent A),覆盖细胞表面
  • 小心抽去 清理液(Reagent A) 
  • 加入1毫升用户自备的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液,铺满细胞表面
  • 放进37培养箱孵育1分种
  • 轻轻抖动培养瓶,使细胞脱落
  • 加入3毫升用户自备的完全细胞培养液
  • 移入到15毫升锥形离心管
  • 放进台式离心机离心5分钟,速度为600g(注意:悬浮细胞可以从这一步开始操作)
  • 小心抽去上清液
  • 加入500微升 染色液(Reagent B),混匀细胞颗粒群
  • 加入5微升 染色液B(Reagent B2),混匀
  • 室温下孵育60分钟,避免光照
  • 放进台式离心机离心5分钟,速度为600g
  • 小心抽去上清液
  • 加入1毫升 清理液(Reagent A),混匀细胞颗粒群
  • 转移到1.5毫升离心管
  • 加入10微升 通透液(Reagent C)
  • 放进37℃培养箱,孵育4分钟(注意:这一步骤决定zui大内质网钙池浓度读数;必要时可以调整孵育时间,既不能过长,导致细胞死亡,又不能过短,导致通透不足)
  • 放进微型台式离心机离心5分钟,速度为600g
  • 小心抽去上清液
  • 加入1毫升 钙化液(Reagent D),混匀细胞颗粒群
  • 室温下孵育5分钟
  • 放进微型台式离心机离心5分钟,速度为600g
  • 小心抽去上清液
  • 加入500微升 清理液(Reagent A),混匀细胞颗粒群
  • 分别移取100微升到5个100微升比色皿或黑色96孔板的4个孔,标记为背景、诱导钙摄入、完全钙摄入、待测抑制剂
  • 按下表分别加入

 

 

背景

诱导钙摄入

完全钙摄入

待测抑制剂

 清理液(Reagent A)

5微升

——

——

——

 摄钙液(Reagent E)

——

——

5微升

——

即刻放进荧光分光光度仪或荧光酶标仪,动态测读2分钟,然后取出比色皿或黑色96孔板,分别加入下列试剂

用户自备的

待测抑制剂

——

——

——

5微升

 诱导液(Reagent F)

——

5微升

——

5微升

意义

基础读数

Mg-ATP依赖性

诱导摄入读数

zui大内质网

钙池浓度读数

NCX抑制剂

摄入读数

 

  • 即刻放进荧光分光光度仪或荧光酶标仪,动态测读3分钟
  • 获得相对荧光读数(Relative Fluorescence Unit;RFU)
  • 分析结果
  • (诱导钙摄入RFU—背景RFU):荧光差值越高,表明NCX转运功能活性越强
  • 【(诱导钙摄入RFU—背景RFU)÷(完全钙摄入RFU—背景RFU)】X 100%=诱导钙摄入百分率:百分率越高,表明NCX转运功能活性越强
  • 构建转运曲线:纵座标(Y)为钙摄入相对荧光单位(RFU),横座标(X)为时间(秒)(注意:参见注意事项8)
  • 构建抑制曲线:纵座标(Y)为荧光差值RFU,横座标(X)为抑制剂浓度(微摩尔)
  • 根据上述曲线,计算IC5050%抑制率所需的抑制剂浓度)

 

二、 直接法

 

  • 准备1个96孔细胞培养板中4个孔的待测细胞,铺满率达70%(5 X 104细胞数/孔),分别标记为背景、诱导钙摄入、完全钙摄入、待测抑制剂
  • 小心抽去细胞培养液
  • 小心加入200微升  清理液(Reagent A) 
  • 小心抽去 清理液(Reagent A) 
  • 小心加入100微升 染色液(Reagent B) 
  • 小心加入1微升 染色液B(Reagent B2)
  • 室温下孵育60分钟,避免光照
  • 小心抽去染色液
  • 加入200微升 清理液(Reagent A) 
  • 加入2微升 通透液(Reagent C)
  • 放进37℃培养箱,孵育4分钟(注意:这一步骤决定zui大内质网钙池浓度读数;必要时可以调整孵育时间,既不能过长,导致细胞死亡,又不能过短,导致通透不足)
  • 小心抽去通透液
  • 加入100微升 钙化液(Reagent D) 
  • 室温下孵育5分钟
  • 小心抽去钙化液
  • 加入200微升 清理液(Reagent A) 
  • 按下表分别加入

 

 

背景

诱导钙摄入

完全钙摄入

待测抑制剂

 清理液(Reagent A)

5微升

——

——

——

 摄钙液(Reagent E)

——

——

5微升

——

即刻放进荧光酶标仪,动态测读2分钟,然后取出黑色96孔板,分别加入下列试剂

用户自备的

待测抑制剂

——

——

——

5微升

 诱导液(Reagent F)

——

5微升

——

5微升

意义

基础读数

Mg-ATP依赖性

诱导摄入读数

zui大内质网

钙池浓度读数

NCX抑制剂

摄入读数

 

  • 即刻放进荧光酶标仪,动态测读3分钟
  • 获得相对荧光读数(Relative Fluorescence Unit;RFU)
  • 分析结果
    • (诱导钙摄入RFU—背景RFU):荧光差值越高,表明NCX转运功能活性越强
    • 【(诱导钙摄入RFU—背景RFU)÷(完全钙摄入RFU—背景RFU)】X 100%=诱导钙摄入百分率:百分率越高,表明NCX转运功能活性越强
    • 构建转运曲线:纵座标(Y)为钙摄入相对荧光单位(RFU),横座标(X)为时间(秒)(注意:参见注意事项8)
    • 构建抑制曲线:纵座标(Y)为荧光差值RFU,横座标(X)为抑制剂浓度(微摩尔)
    • 根据上述曲线,计算IC50(50%抑制率所需的抑制剂浓度)

 

注意事项

 

  • 本产品为20次操作
  • 操作时,须戴手套
  • 孵育时,避免光照
  • 直接法,细胞换液时,避免使细胞脱落;如果细胞贴壁较松,建议使用间接法
  • 可以进行动态或定时荧光检测分析
  • 用户进行抑制剂筛选,建议使用浓度梯度
  • 可以使用NCX抑制毒BENZAMIL作为抑制剂对照
  • 钙离子转运曲线参考图像如下:

 

                                       ∣基础∣   钙摄入曲线  ∣

 

  • 本公司提供系列钙离子膜通道转运功能(transport/uptake)分析试剂产

 

质量标准

 

  • 本产品经鉴定性能稳定
  • 本产品经鉴定荧光清晰

 

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