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钙离子膜通道钠钙交换体(NCX/内质网)试剂盒产品说明书

更新时间:2017-03-21  |  点击率:3188

钙离子膜通道钠钙交换体NCX/内质网)功能荧光检测试剂盒产品说明书

(中文版)

 

主要用途

 

 钙离子膜通道钠钙交换体NCX/内质网)功能荧光检测试剂是一种旨在使用选择性内质网型钙ATP酶、钠钾ATP酶和线粒体钙泵抑制剂的条件下,通过钙离子荧光探针,探测在ATP的激发下,进入内质网内的钙离子,而产生荧光增强,来分析和观察内质网钠钙交换体转运功能的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种动物、人体、真菌/酵母、植物等内质网钠钙交换体活性的检测,以及抑制剂筛选。产品严格无菌,即到即用,操作简捷,性能稳定。

 

技术背景

 

钠钙交换体(sodium-calcium exchanger;Na+-Ca++ exchanger;NCX)是一种反向协同膜蛋白(antiporter membrane protein),常见于兴奋细胞的细胞膜上和线粒体或内置网上,使钙离子排出胞浆外或进入细胞器,通过移除1分子钙离子,交换进入3分子钠离子,达到细胞钙离子微环境稳态平衡,以控制神经分泌、光敏受体活性、心肌松弛、以及兴奋-收缩偶联等功能。钠钙交换体和钙ATP酶不同,其与钙离子的亲和力低。钠钙交换体有5种异构体:NCX1、NCX2、NCX3、NCX-SQ1、CALX。钠钙交换体异常与心肌缺血-再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury)有关。KB R7943、SEA0400和SN-6等是钠钙交换体选择性抑制剂,具有治疗心肌缺血、心律失常、心衰和高血压的药理价值。Mag-Fluo--AM染料是一种钙离子低亲和性的荧光标记染料,特异性地由内质网捕获,可以检测内质网内的游离钙离子浓度的变化,进而分析内质网钠钙交换体的作用模式,监测镁ATP诱导的钙离子摄入,来评价钠钙交换体的功能。其基本检测步骤是,首先引入荧光探针到内质网,其次膜通透处理后,同步加入线粒体钙泵抑制剂FCCP、内质网型钙ATP酶抑制剂毒胡萝卜素(thapsigargin;TG)、钠钾ATP酶抑制剂乌本苷(ouabain)和Mg-ATP,在荧光分光光度仪下(激发波长490nm,散发波长525nm)观察荧光峰值的变化。 

 

产品内容

 

 清理液(Reagent A) 100毫升

 染色液A(Reagent B1)  10毫升

 染色液B(Reagent B2) 100微升

 通透液(Reagent C) 200微升

 钙化液(Reagent D)  20毫升

 摄钙液(Reagent E) 100微升

 诱导液(Reagent F) 200微升

产品说明书   1份

 

保存方式

 

保存 清理液(Reagent A)在4冰箱里,其余的保存在-20冰箱里,避免反复冻融; 染色液B(Reagent B2)避免光照;有效保证6月

 

用户自备

 

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液(  12024):用于细胞脱离

*细胞培养液(  12052):用于细胞处理所需的培养基

15毫升锥形离心管:用于样品操作的容器

1.5毫升离心管:用于样品操作的容器

微型台式离心机:用于样品操作

恒温水槽或培养箱:用于反应孵育

100微升比色皿或黑色96孔板:用于荧光分析的容器

荧光分光光度仪或荧光酶标仪:用于荧光定量分析

 

实验步骤

 

  • 测定准备

 

  • 开启并设定好荧光分光光度仪或荧光酶标仪(温度为22℃):激发波长为490nm,散发波长525nm,间隔30秒测读1次,或动态测读,并置零
  • 实验开始前,将-20℃冰箱里的试剂盒中的试剂置于室温下冻融预热,避免光照。然后进行下列操作

 

  • 荧光测定

 

  • 间接法

 

  • 准备1个25cm2细胞培养瓶的待测细胞,铺满率达70%(1 X 106细胞数)
  • 小心抽去细胞培养液
  • 加入3毫升  清理液(Reagent A),覆盖细胞表面
  • 小心抽去 清理液(Reagent A) 
  • 加入1毫升用户自备的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液,铺满细胞表面
  • 放进37培养箱孵育1分种
  • 轻轻抖动培养瓶,使细胞脱落
  • 加入3毫升用户自备的*细胞培养液
  • 移入到15毫升锥形离心管
  • 放进台式离心机离心5分钟,速度为600g(注意:悬浮细胞可以从这一步开始操作)
  • 小心抽去上清液
  • 加入500微升 染色液(Reagent B),混匀细胞颗粒群
  • 加入5微升 染色液B(Reagent B2),混匀
  • 室温下孵育60分钟,避免光照
  • 放进台式离心机离心5分钟,速度为600g
  • 小心抽去上清液
  • 加入1毫升 清理液(Reagent A),混匀细胞颗粒群
  • 转移到1.5毫升离心管
  • 加入10微升 通透液(Reagent C)
  • 放进37℃培养箱,孵育4分钟(注意:这一步骤决定zui大内质网钙池浓度读数;必要时可以调整孵育时间,既不能过长,导致细胞死亡,又不能过短,导致通透不足)
  • 放进微型台式离心机离心5分钟,速度为600g
  • 小心抽去上清液
  • 加入1毫升 钙化液(Reagent D),混匀细胞颗粒群
  • 室温下孵育5分钟
  • 放进微型台式离心机离心5分钟,速度为600g
  • 小心抽去上清液
  • 加入500微升 清理液(Reagent A),混匀细胞颗粒群
  • 分别移取100微升到5个100微升比色皿或黑色96孔板的4个孔,标记为背景、诱导钙摄入、*钙摄入、待测抑制剂
  • 按下表分别加入

 

 

背景

诱导钙摄入

*钙摄入

待测抑制剂

 清理液(Reagent A)

5微升

——

——

——

 摄钙液(Reagent E)

——

——

5微升

——

即刻放进荧光分光光度仪或荧光酶标仪,动态测读2分钟,然后取出比色皿或黑色96孔板,分别加入下列试剂

用户自备的

待测抑制剂

——

——

——

5微升

 诱导液(Reagent F)

——

5微升

——

5微升

意义

基础读数

Mg-ATP依赖性

诱导摄入读数

zui大内质网

钙池浓度读数

NCX抑制剂

摄入读数

 

  • 即刻放进荧光分光光度仪或荧光酶标仪,动态测读3分钟
  • 获得相对荧光读数(Relative Fluorescence Unit;RFU)
  • 分析结果
  • (诱导钙摄入RFU—背景RFU):荧光差值越高,表明NCX转运功能活性越强
  • 【(诱导钙摄入RFU—背景RFU)÷(*钙摄入RFU—背景RFU)】X 100%=诱导钙摄入百分率:百分率越高,表明NCX转运功能活性越强
  • 构建转运曲线:纵座标(Y)为钙摄入相对荧光单位(RFU),横座标(X)为时间(秒)(注意:参见注意事项8)
  • 构建抑制曲线:纵座标(Y)为荧光差值RFU,横座标(X)为抑制剂浓度(微摩尔)
  • 根据上述曲线,计算IC5050%抑制率所需的抑制剂浓度)

 

二、 直接法

 

  • 准备1个96孔细胞培养板中4个孔的待测细胞,铺满率达70%(5 X 104细胞数/孔),分别标记为背景、诱导钙摄入、*钙摄入、待测抑制剂
  • 小心抽去细胞培养液
  • 小心加入200微升  清理液(Reagent A) 
  • 小心抽去 清理液(Reagent A) 
  • 小心加入100微升 染色液(Reagent B) 
  • 小心加入1微升 染色液B(Reagent B2)
  • 室温下孵育60分钟,避免光照
  • 小心抽去染色液
  • 加入200微升 清理液(Reagent A) 
  • 加入2微升 通透液(Reagent C)
  • 放进37℃培养箱,孵育4分钟(注意:这一步骤决定zui大内质网钙池浓度读数;必要时可以调整孵育时间,既不能过长,导致细胞死亡,又不能过短,导致通透不足)
  • 小心抽去通透液
  • 加入100微升 钙化液(Reagent D) 
  • 室温下孵育5分钟
  • 小心抽去钙化液
  • 加入200微升 清理液(Reagent A) 
  • 按下表分别加入

 

 

背景

诱导钙摄入

*钙摄入

待测抑制剂

 清理液(Reagent A)

5微升

——

——

——

 摄钙液(Reagent E)

——

——

5微升

——

即刻放进荧光酶标仪,动态测读2分钟,然后取出黑色96孔板,分别加入下列试剂

用户自备的

待测抑制剂

——

——

——

5微升

 诱导液(Reagent F)

——

5微升

——

5微升

意义

基础读数

Mg-ATP依赖性

诱导摄入读数

zui大内质网

钙池浓度读数

NCX抑制剂

摄入读数

 

  • 即刻放进荧光酶标仪,动态测读3分钟
  • 获得相对荧光读数(Relative Fluorescence Unit;RFU)
  • 分析结果
    • (诱导钙摄入RFU—背景RFU):荧光差值越高,表明NCX转运功能活性越强
    • 【(诱导钙摄入RFU—背景RFU)÷(*钙摄入RFU—背景RFU)】X 100%=诱导钙摄入百分率:百分率越高,表明NCX转运功能活性越强
    • 构建转运曲线:纵座标(Y)为钙摄入相对荧光单位(RFU),横座标(X)为时间(秒)(注意:参见注意事项8)
    • 构建抑制曲线:纵座标(Y)为荧光差值RFU,横座标(X)为抑制剂浓度(微摩尔)
    • 根据上述曲线,计算IC50(50%抑制率所需的抑制剂浓度)

 

注意事项

 

  • 本产品为20次操作
  • 操作时,须戴手套
  • 孵育时,避免光照
  • 直接法,细胞换液时,避免使细胞脱落;如果细胞贴壁较松,建议使用间接法
  • 可以进行动态或定时荧光检测分析
  • 用户进行抑制剂筛选,建议使用浓度梯度
  • 可以使用NCX抑制毒BENZAMIL作为抑制剂对照
  • 钙离子转运曲线参考图像如下:

 

                                       ∣基础∣   钙摄入曲线  ∣

 

  • 本公司提供系列钙离子膜通道转运功能(transport/uptake)分析试剂产

 

质量标准

 

  • 本产品经鉴定性能稳定
  • 本产品经鉴定荧光清晰

 

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