钙离子膜通道钠钙交换体（NCX/内质网）试剂盒产品说明书

钙离子膜通道钠钙交换体（NCX/内质网）功能荧光检测试剂盒产品说明书

（中文版）

主要用途

 钙离子膜通道钠钙交换体（NCX/内质网）功能荧光检测试剂是一种旨在使用选择性内质网型钙ATP酶、钠钾ATP酶和线粒体钙泵抑制剂的条件下，通过钙离子荧光探针，探测在ATP的激发下，进入内质网内的钙离子，而产生荧光增强，来分析和观察内质网钠钙交换体转运功能的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种动物、人体、真菌/酵母、植物等内质网钠钙交换体活性的检测，以及抑制剂筛选。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。

技术背景

钠钙交换体（sodium-calcium exchanger；Na⁺-Ca⁺⁺ exchanger；NCX）是一种反向协同膜蛋白（antiporter membrane protein），常见于兴奋细胞的细胞膜上和线粒体或内置网上，使钙离子排出胞浆外或进入细胞器，通过移除1分子钙离子，交换进入3分子钠离子，达到细胞钙离子微环境稳态平衡，以控制神经分泌、光敏受体活性、心肌松弛、以及兴奋-收缩偶联等功能。钠钙交换体和钙ATP酶不同，其与钙离子的亲和力低。钠钙交换体有5种异构体：NCX1、NCX2、NCX3、NCX-SQ1、CALX。钠钙交换体异常与心肌缺血-再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury）有关。KB R7943、SEA0400和SN-6等是钠钙交换体选择性抑制剂，具有治疗心肌缺血、心律失常、心衰和高血压的药理价值。Mag-Fluo--AM染料是一种钙离子低亲和性的荧光标记染料，特异性地由内质网捕获，可以检测内质网内的游离钙离子浓度的变化，进而分析内质网钠钙交换体的作用模式，监测镁ATP诱导的钙离子摄入，来评价钠钙交换体的功能。其基本检测步骤是，首先引入荧光探针到内质网，其次膜通透处理后，同步加入线粒体钙泵抑制剂FCCP、内质网型钙ATP酶抑制剂毒胡萝卜素（thapsigargin；TG）、钠钾ATP酶抑制剂乌本苷（ouabain）和Mg-ATP，在荧光分光光度仪下（激发波长490nm，散发波长525nm）观察荧光峰值的变化。 

产品内容

 清理液（Reagent A） 100毫升

 染色液A（Reagent B1）  10毫升

 染色液B（Reagent B2） 100微升

 通透液（Reagent C） 200微升

 钙化液（Reagent D）  20毫升

 摄钙液（Reagent E） 100微升

 诱导液（Reagent F） 200微升

产品说明书   1份

保存方式

保存 清理液（Reagent A）在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里，避免反复冻融； 染色液B（Reagent B2）避免光照；有效保证6月

用户自备

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（  12024）：用于细胞脱离

*细胞培养液（  12052）：用于细胞处理所需的培养基

15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器

1.5毫升离心管：用于样品操作的容器

微型台式离心机：用于样品操作

恒温水槽或培养箱：用于反应孵育

100微升比色皿或黑色96孔板：用于荧光分析的容器

荧光分光光度仪或荧光酶标仪：用于荧光定量分析

实验步骤

• 测定准备

• 开启并设定好荧光分光光度仪或荧光酶标仪（温度为22℃）：激发波长为490nm，散发波长525nm，间隔30秒测读1次，或动态测读，并置零
• 实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的试剂置于室温下冻融预热，避免光照。然后进行下列操作

• 荧光测定

• 间接法

• 准备1个25cm²细胞培养瓶的待测细胞，铺满率达70％（1 X 10⁶细胞数）
• 小心抽去细胞培养液
• 加入3毫升  清理液（Reagent A），覆盖细胞表面
• 小心抽去 清理液（Reagent A） 
• 加入1毫升用户自备的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，铺满细胞表面
• 放进37℃培养箱孵育1分种
• 轻轻抖动培养瓶，使细胞脱落
• 加入3毫升用户自备的*细胞培养液
• 移入到15毫升锥形离心管
• 放进台式离心机离心5分钟，速度为600g（注意：悬浮细胞可以从这一步开始操作）
• 小心抽去上清液
• 加入500微升 染色液（Reagent B），混匀细胞颗粒群
• 加入5微升 染色液B（Reagent B2），混匀
• 室温下孵育60分钟，避免光照
• 放进台式离心机离心5分钟，速度为600g
• 小心抽去上清液
• 加入1毫升 清理液（Reagent A），混匀细胞颗粒群
• 转移到1.5毫升离心管
• 加入10微升 通透液（Reagent C）
• 放进37℃培养箱，孵育4分钟（注意：这一步骤决定zui大内质网钙池浓度读数；必要时可以调整孵育时间，既不能过长，导致细胞死亡，又不能过短，导致通透不足）
• 放进微型台式离心机离心5分钟，速度为600g
• 小心抽去上清液
• 加入1毫升 钙化液（Reagent D），混匀细胞颗粒群
• 室温下孵育5分钟
• 放进微型台式离心机离心5分钟，速度为600g
• 小心抽去上清液
• 加入500微升 清理液（Reagent A），混匀细胞颗粒群
• 分别移取100微升到5个100微升比色皿或黑色96孔板的4个孔，标记为背景、诱导钙摄入、*钙摄入、待测抑制剂
• 按下表分别加入

• 即刻放进荧光分光光度仪或荧光酶标仪，动态测读3分钟
• 获得相对荧光读数（Relative Fluorescence Unit；RFU）
• 分析结果

• （诱导钙摄入RFU—背景RFU）：荧光差值越高，表明NCX转运功能活性越强
• 【（诱导钙摄入RFU—背景RFU）÷（*钙摄入RFU—背景RFU）】X 100%=诱导钙摄入百分率：百分率越高，表明NCX转运功能活性越强
• 构建转运曲线：纵座标（Y）为钙摄入相对荧光单位（RFU），横座标（X）为时间（秒）（注意：参见注意事项8）
• 构建抑制曲线：纵座标（Y）为荧光差值RFU，横座标（X）为抑制剂浓度（微摩尔）
• 根据上述曲线，计算IC50（50％抑制率所需的抑制剂浓度）

二、 直接法

• 准备1个96孔细胞培养板中4个孔的待测细胞，铺满率达70％（5 X 10⁴细胞数/孔），分别标记为背景、诱导钙摄入、*钙摄入、待测抑制剂
• 小心抽去细胞培养液
• 小心加入200微升  清理液（Reagent A） 
• 小心抽去 清理液（Reagent A） 
• 小心加入100微升 染色液（Reagent B） 
• 小心加入1微升 染色液B（Reagent B2）
• 室温下孵育60分钟，避免光照
• 小心抽去染色液
• 加入200微升 清理液（Reagent A） 
• 加入2微升 通透液（Reagent C）
• 放进37℃培养箱，孵育4分钟（注意：这一步骤决定zui大内质网钙池浓度读数；必要时可以调整孵育时间，既不能过长，导致细胞死亡，又不能过短，导致通透不足）
• 小心抽去通透液
• 加入100微升 钙化液（Reagent D） 
• 室温下孵育5分钟
• 小心抽去钙化液
• 加入200微升 清理液（Reagent A） 
• 按下表分别加入

• 即刻放进荧光酶标仪，动态测读3分钟
• 获得相对荧光读数（Relative Fluorescence Unit；RFU）
• 分析结果
  • （诱导钙摄入RFU—背景RFU）：荧光差值越高，表明NCX转运功能活性越强
  • 【（诱导钙摄入RFU—背景RFU）÷（*钙摄入RFU—背景RFU）】X 100%=诱导钙摄入百分率：百分率越高，表明NCX转运功能活性越强
  • 构建转运曲线：纵座标（Y）为钙摄入相对荧光单位（RFU），横座标（X）为时间（秒）（注意：参见注意事项8）
  • 构建抑制曲线：纵座标（Y）为荧光差值RFU，横座标（X）为抑制剂浓度（微摩尔）
  • 根据上述曲线，计算IC50（50％抑制率所需的抑制剂浓度）

注意事项

• 本产品为20次操作
• 操作时，须戴手套
• 孵育时，避免光照
• 直接法，细胞换液时，避免使细胞脱落；如果细胞贴壁较松，建议使用间接法
• 可以进行动态或定时荧光检测分析
• 用户进行抑制剂筛选，建议使用浓度梯度
• 可以使用NCX抑制剂毒BENZAMIL作为抑制剂对照
• 钙离子转运曲线参考图像如下：

                                       ∣基础∣   钙摄入曲线  ∣

• 本公司提供系列钙离子膜通道转运功能（transport/uptake）分析试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定荧光清晰