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细菌呼吸链复合物3(bc-1 complex)活性光度法定量检测试剂盒简介

更新时间:2021-08-27  |  点击率:1383

 细菌呼吸链复合物3bc-1 complex)活性光度法定量检测试剂盒产品说明书

(中文版)

 

主要用途

 

   细菌呼吸链复合物3bc-1 complex)活性光度法定量检测试剂是一种旨在使用还原性合成辅酶Q同功类似物和特异性抑制剂,通过反应系统测定样品中细胞色素C还原后峰值的增高,即采用比色法测定样品中酶活性的*而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的其适合于各种野生、培养或病原性细菌膜蛋白悬液样品的辅酶Q-细胞色素C还原酶的特异性活性检测。产品不含污染性蛋白酶,严格无菌,即到即用,操作简捷,性能稳定,反应优化,检测敏感。

 

技术背景

 

细菌呼吸链复合物III,通常称为辅酶Q-细胞色素C还原酶、细胞色素还原酶或bc1复合物ubiquinol cytochrome c oxidoreductasecytochrome reductasebc1 complex),是细菌电子传递链的中心元素,位于革兰氏阴性和阳性细菌(除大肠杆菌和古生菌等),包括光合成细菌的细胞膜上,为寡聚体膜蛋白复合物。细菌使用氧气、氮、硫化物等作为终端电子受体。细菌复合物III含有三个亚单位,包括细胞色素bCytochrome b),细胞色素c1cytochrome c1)和Rieske铁硫蛋白Rieske iron-sulfur protein,通过Q循环(Q cycle)进行催化作用。其特征性的酶活性是抗霉素敏感的辅酶Q-细胞色素C还原酶。复合物III催化氧化型细胞色素C被还原为还原型细胞色素C,细菌内电子由低电位的供体还原型泛醌(ubiquinolUQH2)或还原型辅酶Qreduced Coenzyme QCoQH2)传递到细胞色素C或质体蓝素(plastocyanin)上的能量转移反应,进行呼吸链传递。细菌复合物3和复合物4的相互作用,形成泛醌氧化酶(quinol oxidase辅酶Q-细胞色素C还原酶反应系统测定氧化型细胞色素C的浓度变化。基于还原型泛醌或还原型辅酶Q底物,在抗霉素存在与否的情况下,通过辅酶Q-细胞色素C还原酶的催化,转化成泛醌(ubiquinoneUQ)或辅酶QCoenzyme QCoQ),同时氧化型细胞色素C转化为还原型细胞色素C,在分光光度仪下产生吸光峰值的变化550nm 波长),由此定量测定辅酶Q-细胞色素C还原酶的特异活性。其反应系统是:

 

 

产品内容

 

   缓冲液(Reagent A         毫升

   反应液(Reagent B             微升

   阴性液(Reagent C           毫升

   底物液(Reagent D          微升

   专性液(Reagent E           微升

   稳定液AReagent F1         

   稳定液BReagent F2         毫升

产品说明书               1

 

保存方式

 

保存在-20冰箱里,避免反复冻融   反应液(Reagent B)和   底物液(Reagent D),避免光照,有效保证3

 

用户自备

 

比色皿:用于比色的容器

分光光度仪:用于比色分析

培养箱:用于孵育反应物

 

实验步骤

 

实验开始前,将-20℃冰箱里的试剂盒中的试剂溶液置入冰槽里融化;   反应液(Reagent B   底物液(Reagent D注意避光 

 

一、 测定准备

 

1. 准备好待测样品(例如细菌膜蛋白样品等),置于冰槽里 

2. 设定好分光光度仪(温度为30℃):波长为550nm,间隔60秒,读数3次(共2分钟),并置零

3.    缓冲液(Reagent A室温下均衡温度

4. 实验开始前,将-20℃冰箱里的试剂盒中的   稳定液BReagent F2置入冰槽里融化,然后移出xx毫升到   稳定液AReagent F1管里,混匀后,标记为   稳定工作液置于冰槽里备用(注意,15分钟内使用,用完后丢弃)然后将-20℃冰箱里的试剂盒中的   反应液(Reagent B室温下融化,然后移出10微升到新的1.5毫升离心管,加入xx微升   稳定工作,轻柔混匀后,室温下避光静置15分钟(可见颜色变白),标记为   反应工作液。然后即刻进行下列操作

 

二、 背景对照测定

 

1. 移取xx微升   缓冲液(Reagent A到新的比色皿

2. 加入10微升   反应工作 

3. 加入xx微升   底物液(Reagent D

4. 室温下静置10分钟,避免光照

5. 加入xx微升   阴性液(Reagent C

6. 上下倾倒数次,混匀(限定在3秒之内)

7. 即刻放入分光光度仪检测,此为背景空对照:550波长读数1分钟或2分钟550波长读数0分钟 

 

三、 样品总活性测定

 

1. 移取xx微升   缓冲液(Reagent A到新的比色皿

2. 加入10微升   反应工作

3. 加入xx微升   底物液(Reagent D

4. 室温下静置10分钟,避免光照

5. 加入100微升待测样品(注意:15微克细菌膜蛋白

6. 上下倾倒数次,混匀(限定在3秒之内)

7. 即刻放入分光光度仪检测,此为样品总活性读数:550波长读数1分钟或2分钟550波长读数0分钟

 

四、 样品非特异活性测定

 

1. 移取xx微升   缓冲液(Reagent A到新的比色皿

2. 加入10微升   反应工作,避免光照

3. 加入xx微升   底物液(Reagent D

4. 室温下静置10分钟,避免光照

5. 加入xx微升   专性液(Reagent E

6. 加入100微升待测样品(注意:15微克细菌膜蛋白

7. 上下倾倒数次,混匀(限定在3秒之内)

8. 即刻放入分光光度仪检测,此为样品特异活性读数:550波长读数1分钟或2分钟550波长读数0分钟

 

五、 计算样品活性

 

1)样品活性(总活性和非特异活性)

 

 

2)样品特异活性

 

 

注意事项

 

1. 本产品为21次操作(10个样本),包括1次背景对照测定

2. 操作时,须戴手套

3. 系统操作过程中,背景测定只需1

4. 如果增强酶活检测,建议使用细菌膜蛋白样品。推荐使用   细菌呼吸链复合物检测样品制备试剂盒    15142

5. 每增加1个样品,增加   反应工作液为:   反应液(Reagent B5微升+   稳定工作5微升,以此类推。配制反应工作液时,须根据样本数量配制实际工作液容量

6. 用户可以根据实际样品,计算   缓冲液(Reagent A   反应工作   底物液(Reagent D三者之和,混匀后,室温下静置10分钟后,即刻检测

7. 加入样品启动反应3秒内即刻比色测定

8. 分光光度计波长严格设置在550nm,误差10nm将不产生信号

9. 测定可以持续2分钟

10. 测定值由低到高变化,即2分钟测定读数高于0分钟测定读数,表明有酶活性

11. 比色测定后,比色皿须清洗*

12. 建议用户使用分光光度仪检测,总体系减半可以增加检测样本数

13. 建议待测样本蛋白浓度为15微克/100微升;如果样本酶活性过低或过高,则可以增加或降低样本量;注意计算公式的调整(本公司提供    Bradford蛋白质浓度定量试剂盒    30030.1

14. 如果使用细裂解液,则蛋白浓度为50微克/100微升

15. 样品特异活性是指抗霉素敏感的辅酶Q-细胞色素C还原酶,去除其它干扰因素(例如复合物I/II/IV等)

16. 细菌呼吸链复合物III(辅酶Q-细胞色素C还原酶)单位活性定义为:在30℃,pH 7.5条件下,每分钟内能够氧化1微摩尔还原型泛醌CoQH2所需的酶量作为一个活性单位

17. 本公司提供系列细菌酶类技术产品

 

质量标准

 

1. 本产品经鉴定性能稳定

2. 本产品经鉴定检测准确

 

 

 

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