细胞ADP/ATP比值生物发光法检测试剂盒产品说明书（中文版）

 细胞ADP/ATP比值生物发光法检测试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

  细胞ADP/ATP比值生物发光法检测试剂是一种旨在通过萤火虫荧光素酶反应系统，荧光素在酶的催化下，与ATP发生反应，产生生物光能，采用冷光仪测定其相对冷光单位的变化，来定量分析丙酮酸激酶处理前后获得的细胞样品（包括裂解或悬液）中ADP/ATP比值的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞（动物、人体）的ADP/ATP比值（ratio）检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，高度敏感。

技术背景

腺嘌呤核苷酸（adenine nucleotides），简称腺苷，包括单磷酸腺苷、二磷酸腺苷和三磷酸腺苷，是一种单体单位，为核糖核酸（RNA）和脱氧核糖核酸（DNA）的组成成分，并提供化学能量，在能量代谢通路中维护诸如肌肉、胞膜等组织细胞结构的生化和生理功能，调节细胞糖酵解、三羧酸循环、电子传递系统、氧化磷酸化活动。腺嘌呤核苷酸在细胞中浓度低，且不稳定，通常通过其类型不同、浓度差异、分布状况，来评价细胞的代谢情况和能量状态。二磷酸腺苷（adenosine diphosphate；ADP），参与ADP-ATP循环，提供热能转换和动态平衡，尤其在线粒体需氧呼吸、光合成等实现。三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate；ATP）存在于所有代谢活跃的细胞内，是细胞活力的标志。一旦细胞凋亡或坏死，ATP浓度急遽下降。ADP/ATP比值（ADP/ATP ratio）常用于区分细胞死亡与存活的方式：繁殖、凋亡、坏死。在细胞活力和药物发现研究中广泛运用。萤火虫荧光素酶（Firefly luciferase）是62 kd 的单体蛋白，催化ATP依赖性荧光素（luciferin）的氧化，经过电子转移，将化学能转化为氧化型荧光素（oxyluciferin）的光能，与ATP量成线性正相关。首先通过生物发光仪（560nm）检测，定量ATP浓度，而后在丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）的存在下，将ADP转化为ATP后，再次通过生物发光仪检测，以定量ADP浓度，最终获得ADP/ATP比值。其反应方式为：

产品内容

  清理液（Reagent A）         毫升

  裂解液（Reagent B）         毫升

  缓冲液（Reagent C）         毫升

  反应液（Reagent D）         微升

  转化液（Reagent E）          微升

产品说明书               1份

保存方式

保存  清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里，严格避免光照和反复冻融；有效保证3月

用户自备

1.5毫升离心管：用于样品保存的容器

15毫升锥形离心管：用于样品处理的容器

黑色96孔板：用于冷光检测操作的容器

（微型）台式离心机：用于样品操作

冷光仪：用于样品冷光检测

实验步骤

一、 待测样品准备

1． 准备好25cm²细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 X 10⁶细胞）

2． 小心抽去培养液（注意：如果检测细胞培养上清的ATP活性，则可以收集后按照下述活性测定步骤直接检测）

3． 小心加入xx毫升  清理液（Reagent A），覆盖生长表面

4． 小心抽去清理液

5． 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：可以使用胰酶消化）

6． 加入xx毫升  清理液（Reagent A），混匀细胞

7． 移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）

8． 放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g

9． 小心抽去上清液

10． 加入xx微升  裂解液（Reagent B），充分混匀

11． 转移到预冷的1.5毫升离心管

12． 强力涡旋震荡15秒

13． 置于冰槽里孵育30分钟

14． 放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

15． 小心移取500微升上清液到新的无菌的1.5毫升离心管

16． 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

二、 测定准备

1． 设置好冷光仪：温度25℃，1秒延时（Delay），1秒整合（Integration）检测。同时关上操作室的灯光

2． 测定开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的  缓冲液（Reagent C）置入冰槽里融化，然后移出500微升到新的1.5毫升离心管，加入xx微升  反应液（Reagent D），轻柔混匀后，置于冰槽里，标记为  反应工作液，放在暗室冰槽里备用。然后进行下列操作。

三、 活性测定

1． 准备1个黑色96孔板 

2． 加入50微升待测样品

3． 加入xx微升  反应工作液

4． 室温下（25℃）孵育1分钟，避免光照

5． 即刻放进冷光仪检测（1秒延时，1秒检测）：获得ATP相对发光单位（Relative Light Unit；RLU）

6． 室温下（25℃）静置10分钟，避免光照

7． 即刻放进冷光仪检测（1秒延时，1秒检测）：获得ADP背景相对发光单位（Relative Light Unit；RLU）

8． 加入xx微升  转化液（Reagent E）

9． 室温下（25℃）孵育1分钟，避免光照

10． 即刻放进冷光仪检测（1秒延时，1秒检测）：获得ADP相对发光单位（Relative Light Unit；RLU）

11． 计算样品ADP/ATP比值

ADP/ATP比值=（ADP相对发光单位—ADP背景相对发光单位）÷ATP相对发光单位

12． 结果分析（参考）

注意事项

1． 本产品为50次操作

2． 所有操作均须无菌状态下进行

3． 操作时，须戴手套

4． 建议每个样品安排3个孔，即重复3次，计算时取其平均值

5．   反应液（Reagent D）具有光高度敏感性，因此整个操作须避光进行，避免反复冻融

6． 由于ATP无处不在，且热稳定性。建议使用的枪头、用具须严格无菌，避免重复使用；操作时避免污染试剂溶液，不得用手触摸试剂容器的内盖

7． 如果用户没有冷光仪，可以使用闪烁探测器（scitillation counter 或β计数器）替代，但敏感性较低

8． 如果是注射式冷光仪，建议测试前后使用无离子水冲洗冷光仪注射（injector）管道

9． 本公司提供系列ATP检测试剂产品

质量标准

1． 本产品经鉴定性能稳定

2． 本产品经鉴定检测敏感