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细菌赖氨酸牙龈卟啉菌蛋白酶(LYS-GINGIPAIN)活性比色法定量

更新时间:2023-02-22  |  点击率:484

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 细菌赖氨酸牙龈卟啉菌蛋白酶(LYS-GINGIPAIN)活性比色法定量检测试剂盒产品说明书(中文版)

 

主要用途

 

 细菌赖氨酸牙龈卟啉菌蛋白酶(LYS-GINGIPAIN)活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过单肽化合物底物acetyl-Lys-pNA受到氨酸牙龈卟啉菌蛋白酶的水解,释放出黄色对硝基苯胺即采用比色法来测定样品中酶活性而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的其适用于各种牙周炎细菌裂解萃取液、培养上清、牙周缝隙液体等样品氨酸牙龈卟啉菌蛋白酶的特异活性检测。产品严格无菌,即到即用,操作简捷,性能稳定。

 

技术背景

 

牙龈卟啉菌蛋白酶(gingipain)是一种胰蛋白酶类半胱氨酸蛋白酶(cysteine proteinase),常见于细菌表面、细胞外基质囊泡内以及细菌培养上清,为膜结合型和细胞外分泌型,有2个类型:精氨酸依赖特异性(arginine specificRgp)和赖氨酸依赖特异性(lysine specificKgp)。前者有2个同工酶:RgpARgpBRgpA又分成HRgpARgpAcat)和mtRgpARgpB又分成RgpBmtRgpB。牙龈卟啉菌蛋白酶也是一种毒力因子,为革兰氏阴性厌氧细菌牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、等多种细菌生长提供营养,使血液凝结和纤维溶解(fibrinolytic)通路,以及免疫系统失调,激活激肽释放酶(kallikerin)和激肽(kinin)通路,调节宿主细胞因子网络,活化基质金属蛋白酶和血小板,切离层粘连蛋白(laminin)、纤连蛋白(fibronectin)、胶原蛋白等,间接促成牙周组织浸入和破坏,诱导细胞凋亡、CAM分子分解和细胞脱离(失巢凋亡anoikis),导致牙周病发生,甚至心血管疾病、风湿性关节炎和阿茨罕默症等。牙龈卟啉菌蛋白酶成为药物靶标。基于人工合成的单肽化合物底物acetyl-Lys-p-Nitroaniline;乙酰赖氨酰对硝基苯胺),受到氨酸牙龈卟啉菌蛋白酶的水解,释放出黄色对硝基苯胺405nm 波长),来定量测定氨酸牙龈卟啉菌蛋白酶的特异活性。氨酸牙龈卟啉菌蛋白酶反应系统为:

 

 

产品内容

 

 裂解液(Reagent A         毫升

 缓冲液(Reagent B         毫升

 阴性液(Reagent C           毫升

 底物液(Reagent D           微升

产品说明书              1

 

保存方式

 

保存在-20冰箱里; 底物液(Reagent D)避免光照和反复冻融;有效保证6

 

用户自备

 

1.5毫升离心管:用于样品操作的容器

微型台式离心机:用于样品沉淀

培养箱:用于反应物孵育

96孔板或100微升1厘米光径比色皿:用于样品比色测定的容器

酶标仪或分光光度仪:用于样品比色分析

 

实验步骤

 

一、 样品制备

 

1. 准备好500微升待测细菌(OD6000.81,即12 X 107/毫升)

2. 转移到到1.5毫升离心管

3. 放进4微型台式离心机离心5分钟,速度为1000g(或3500RPM,例如EPPENDORF 5415

4. 小心移取上清液到新鲜的1.5毫升离心管——此为占85%细菌外分泌型酶蛋白

5. 加入xx微升 裂解液(Reagent A,充分混匀

6. 强力涡旋震荡15

7. 置于冰槽里15分钟

8. 放进4微型台式离心机离心15分钟,速度为16000g(或13000RPM,例如eppendorf 5415

9. 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管——此为占细菌内结合型酶蛋白

10. 分别移取10微升进行蛋白定量检测(注意:建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒-GMS30030.1

11. 即刻放进-70保存或置于冰槽里继续后续操作

 

二、 测定准备

 

1. 准备好上述制备的待测样品

2. 设定好酶标仪(温度为37℃):波长405nm

3. 实验开始前,将-20℃冰箱里的试剂盒中的 底物液(Reagent D手心融化,避免光照

 

三、 活性测定

 

1. 96孔板上做好相应标记:背景对照和样品

2. 分别移取xx微升 缓冲液(Reagent B到相应孔

3. 分别加入xx微升 阴性液(Reagent C或上述制备的待测样品(50微克蛋白)到相应孔(注意:样品须清澈

4. 分别加入xx微升 底物液(Reagent D

5. 轻轻摇动96孔板(注意:避免气泡

6. 37℃温度下孵育30分钟(注意:可见反应孔里呈现肉眼可见的黄色

7. 即刻放进酶标仪检测或转移到100微升比色皿,在分光光度仪里检测

8. 活性计算:

 

 

(1) 酶标仪检测

 

 

(2) 比色皿检测

 

 

注意事项

 

1. 本产品为21次(96孔板)操作,包括背景对照

2. 操作时,须戴手套

3. 系统操作过程中,背景测定只需1

4. 样品须澄清,且避免反复冻融

5. 建议待测样本蛋白浓度为50微克/5微升;如果样本酶活性过低,即30分钟读数过低,则可以延长反应孵育时间至2小时;其次增加样本量(本公司提供  Bradford蛋白质浓度定量试剂盒GMS30030.1

6. 如果待测样品浓度过高或过低,可以调整样品浓度

7. 氨酸牙龈卟啉菌蛋白酶单位活性定义为:在37pH 7.6条件下,每分钟内能够切离1微摩尔肽化合物底物所需的酶量作为一个活性单位

8. 本公司提供系列牙龈卟啉菌蛋白酶学检测试剂产品

 

质量标准

 

1. 本产品经鉴定性能稳定

2. 本产品经鉴定检测敏感

 

 


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