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人体端粒酶逆转录酶hTERT表达实时定量检测试剂盒产品说明书(中文版)

更新时间:2021-09-07  |  点击率:1854

人体端粒酶逆转录酶hTERT表达实时定量检测试剂盒产品说明书(中文版)

 

主要用途

 

  人体端粒酶逆转录酶hTERT表达实时定量检测试剂是一种旨在运用SYBR绿色荧光染料作为标记信号既方便、快速地进行各种DNA模板的扩增,又实时检测和定量分析扩增产物,即端粒酶逆转录酶活性的*而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。广泛应用于肿瘤、衰老等研究。产品即到即用,性能稳定,无核酶污染,操作便捷,敏感高效,定量准确,重复性强,效果满意,质量保证。

 

技术背景

 

人体端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptasehTERT),又称hTRThTCS1 hEST2是端粒酶的核心结构,即催化亚体(catalytic subunit)。hTERT的功能性表达是端粒酶获得活性的前提。hTERT可以激活端粒酶,使细胞获得永生化hTERT是端粒酶活性的限速决定成分,其mRNA表达水平与端粒酶活性之间具有密切的相关性。hTERT是一单拷贝基因,定位于5q15.33,属于逆转录酶家族,具有进化上的保守性,序列总长约35kb,由16个外显子和15个内含子组成。端粒酶特异性T-motif7个同源保守序列的RT-motif分别位于不同的外显子上hTERTmRNA 还有7种不同的剪切转录本,分为缺失型与插入型两类

 

产品内容

 

  引导液Reagent A            微升  

  逆转液(Reagent B                微升

  补充液(Reagent C         毫升

  反应液(Reagent D         微升

  内参液(Reagent E         微升

  染色液(Reagent F         微升

  封隔液(Reagent G         毫升

产品说明书            1

 

保存方式

 

保存在-20冰箱里,避免反复冻融;  染色液(Reagent F避免光照,有效保证6

 

用户自备

 

RNA样品:用于逆转录扩增的模板

PCR管:用于样品操作的容器

恒温水槽或干式恒温仪:用于反应孵育

微型台式离心机:用于沉降反应物

荧光定量PCR仪:用于荧光定量PCR反应

实验步骤

 

实验开始前,将-20℃冰箱里的试剂和用户自备的总RNA样品置入冰槽里融化;同时将干式恒温仪分别设置到70℃和37℃。然后进行下列操作。

 

一、cDNA合成

 

1. 分别将融化的试剂盒里的试剂溶液涡旋震荡2

2. 放进微型台式离心机瞬时离心5

3. 移出xx微升  引导液(Reagent A到新的0.5毫升PCR

4. 加入8微升用户自备的RNA样品(1微克总RNA样品)

5. 用枪头混匀

6. 放进70℃干式恒温仪孵育3分钟

7. 即刻放进冰槽里

8. 加入xx微升  逆转液(Reagent B

9. 用枪头混匀

10. 放进微型台式离心机瞬时离心5

11. 放进37℃干式恒温仪孵育60分钟

12. 即刻放进冰槽里

13. 加入xx微升  补充液(Reagent C稀释,混匀

14. 置入冰槽里备用或放进-20℃冰箱里保存

 

二、实时定量PCR

 

1. 一次反应总量为25微升

2. 分别移取xx微升  反应液(Reagent D  内参液(Reagent E20.5毫升PCR管,并做好标记

3. 分别加入2微升已知cDNA合成物(注意:可以根据标准曲线计算得知;参见注意事项9

4. 分别加入xx微升  染色液(Reagent F

5. 分别加入xx微升  补充液(Reagent C到总量25微升

6. 放进4℃微型台式离心机瞬时离心5

7. 使用1000微升枪头加入xx  封隔液(Reagent G(注意:参见注意事项12

8. 即刻放进荧光定量PCR

9. 荧光定量PCR反应程序为:

温度(

时间

循环

95

2分钟

1

95

60

72

30

30

30

 

4045

 

72

5分钟

1

10. 采集数据,进行溶解曲线分析

11. PCR产物置于-20℃保存备用

12. 或进行琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物的特异性hTERT片段为120bp;内参GAPDH片段为150bp

 

三、表达计算

 

表达量:定义为相对于正常对照样品的hTERT表达水平

GAPDH:内参,作为调节样品水平的参考指标

对照:用户可以使用hTERT低表达的正常细胞或组织作为比较对照,建议使用正常淋巴细胞

 

注意事项

 

1. 本产品为50次操作(包括50cDNA合成,100次实时定量扩增)

2. 操作时,须戴手套

3. 本产品适合各种荧光定量PCR

4. 建议整个操作在4℃下进行

5. 必须使用带滤芯的枪头

6. 所有器皿、离心管、液体等无RNA酶污染

7. 使用时,避免污染母液

8. 建议选用正常淋巴细胞作为正常对照或校正对照,以此作为评价hTERT的参考指标;用户可以选用任何其它正常细胞或组织,例如肿瘤组织旁的正常组织等

9. 建议选用hTERT阳性表达的MCF7细胞作为阳性对照,以此构建标准曲线:纵坐标(Y轴)为Ct值,横坐标(X轴)为已知细胞量对数值或拷贝数或RNA量等,其*有效用量作为样品检测量的标准

10. 建议使用无模板作为阴性对照

11.   内参液(Reagent E为看家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenaseGAPDH)作为比较分析时样品测试用量校正统一的参考标准

12. 根据用户PCR仪的性能,决定是否加入  封隔液(Reagent D

13. 配制完成后,即刻进行扩增反应,以确保反应物的活性

14. 试剂避免反复冻融

15. PCR扩增反应的最初3个循环为定量基线;315个循环的荧光信号的10倍值为荧光阈值;荧光信号达到阈值所需的循环数为Ct值(参考图像如下)

 

16. Ct值可以作为hTERT表达的计量单位,也可以根据标准曲线转换为表达分子数进行计量

17. 本公司提供系列端粒酶活性检测试剂产品

 

质量标准

1. 本产品经鉴定性能稳定

2. 本产品经鉴定无核酶污染


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