您好!欢迎访问铭修(上海)生物科技有限公司网站!
全国服务咨询热线:

18930233920

当前位置:首页 > 技术文章 > 细菌赖氨酸牙龈卟啉菌蛋白酶(LYS-GINGIPAIN)活性比色法

细菌赖氨酸牙龈卟啉菌蛋白酶(LYS-GINGIPAIN)活性比色法

更新时间:2021-03-10  |  点击率:1195

细菌赖氨酸牙龈卟啉菌蛋白酶(LYS-GINGIPAIN)活性比色法定量检测试剂盒产品说明书(中文版)

 

主要用途

 

  细菌赖氨酸牙龈卟啉菌蛋白酶(LYS-GINGIPAIN)活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过单肽化合物底物acetyl-Lys-pNA受到氨酸牙龈卟啉菌蛋白酶的水解,释放出黄色对硝基苯胺即采用比色法来测定样品中酶活性的*而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的其适用于各种牙周炎细菌裂解萃取液、培养上清、牙周缝隙液体等样品氨酸牙龈卟啉菌蛋白酶的特异活性检测。产品严格无菌,即到即用,操作简捷,性能稳定。

 

技术背景

 

牙龈卟啉菌蛋白酶(gingipain)是一种胰蛋白酶类半胱氨酸蛋白酶(cysteine proteinase),常见于细菌表面、细胞外基质囊泡内以及细菌培养上清,为膜结合型和细胞外分泌型,有2个类型:精氨酸依赖特异性(arginine specificRgp)和赖氨酸依赖特异性(lysine specificKgp)。前者有2个同工酶:RgpARgpBRgpA又分成HRgpARgpAcat)和mtRgpARgpB又分成RgpBmtRgpB。牙龈卟啉菌蛋白酶也是一种毒力因子,为革兰氏阴性厌氧细菌牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、等多种细菌生长提供营养,使血液凝结和纤维溶解(fibrinolytic)通路,以及免疫系统失调,激活激肽释放酶(kallikerin)和激肽(kinin)通路,调节宿主细胞因子网络,活化基质金属蛋白酶和血小板,切离层粘连蛋白(laminin)、纤连蛋白(fibronectin)、胶原蛋白等,间接促成牙周组织浸入和破坏,诱导细胞凋亡、CAM分子分解和细胞脱离(失巢凋亡anoikis),导致牙周病发生,甚至心血管疾病、风湿性关节炎和阿茨罕默症等。牙龈卟啉菌蛋白酶成为药物靶标。基于人工合成的单肽化合物底物acetyl-Lys-p-Nitroaniline;乙酰赖氨酰对硝基苯胺),受到氨酸牙龈卟啉菌蛋白酶的水解,释放出黄色对硝基苯胺405nm 波长),来定量测定氨酸牙龈卟啉菌蛋白酶的特异活性。氨酸牙龈卟啉菌蛋白酶反应系统为:

 

 

产品内容

 

  裂解液(Reagent A  毫升

  缓冲液(Reagent B  毫升

  阴性液(Reagent C    毫升

  底物液(Reagent D    微升

产品说明书     1

 

保存方式

 

保存在-20冰箱里;  底物液(Reagent D)避免光照和反复冻融;有效保证6

 

用户自备

 

1.5毫升离心管:用于样品操作的容器

微型台式离心机:用于样品沉淀

培养箱:用于反应物孵育

96孔板或100微升1厘米光径比色皿:用于样品比色测定的容器

酶标仪或分光光度仪:用于样品比色分析

 

实验步骤

  

  • 样品制备

 

  • 准备好500微升待测细菌(OD6000.81,即12 X 107/毫升)
  • 转移到到1.5毫升离心管
  • 放进4微型台式离心机离心5分钟,速度为1000g(或3500RPM,例如EPPENDORF 5415
  • 小心移取上清液到新鲜的1.5毫升离心管——此为占85%细菌外分泌型酶蛋白
  • 加入xx微升  裂解液(Reagent A,充分混匀
  • 强力涡旋震荡15
  • 置于冰槽里15分钟
  • 放进4微型台式离心机离心15分钟,速度为16000g(或13000RPM,例如eppendorf 5415
  • 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管——此为占细菌内结合型酶蛋白
  • 分别移取10微升进行蛋白定量检测(注意:建议使用   Bradford蛋白质浓度定量试剂盒-   30030.1
  • 即刻放进-70保存或置于冰槽里继续后续操作

 

  • 测定准备

 

  • 准备好上述制备的待测样品
  • 设定好酶标仪(温度为37℃):波长405nm
  • 实验开始前,将-20℃冰箱里的试剂盒中的  底物液(Reagent D手心融化,避免光照

 

  • 活性测定

 

  • 96孔板上做好相应标记:背景对照和样品
  • 分别移取xx微升  缓冲液(Reagent B到相应孔
  • 分别加入xx微升  阴性液(Reagent C或上述制备的待测样品(50微克蛋白)到相应孔(注意:样品须清澈
  • 分别加入xx微升  底物液(Reagent D
  • 轻轻摇动96孔板(注意:避免气泡
  • 37℃温度下孵育30分钟(注意:可见反应孔里呈现肉眼可见的黄色
  • 即刻放进酶标仪检测或转移到100微升比色皿,在分光光度仪里检测
  • 活性计算:

 

 

  • 酶标仪检测

 

 

  • 比色皿检测

 

 

注意事项

 

  • 本产品为21次(96孔板)操作,包括背景对照
  • 操作时,须戴手套
  • 系统操作过程中,背景测定只需1
  • 样品须澄清,且避免反复冻融
  • 建议待测样本蛋白浓度为50微克/5微升;如果样本酶活性过低,即30分钟读数过低,则可以延长反应孵育时间至2小时;其次增加样本量(本公司提供    Bradford蛋白质浓度定量试剂盒 30030.1
  • 如果待测样品浓度过高或过低,可以调整样品浓度
  • 氨酸牙龈卟啉菌蛋白酶单位活性定义为:在37pH 7.6条件下,每分钟内能够切离1微摩尔肽化合物底物所需的酶量作为一个活性单位
  • 本公司提供系列牙龈卟啉菌蛋白酶学检测试剂产品

 

质量标准

 

  • 本产品经鉴定性能稳定
  • 本产品经鉴定检测敏感

 

 

扫一扫,关注微信
地址:上海市杨浦区武宁路269号 传真:86-021-55825868
©2024 铭修(上海)生物科技有限公司 版权所有 All Rights Reserved.  备案号:沪ICP备16032190号-1