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精浆柠檬酸定量试剂盒应该怎么做?这个步骤可以解惑!

更新时间:2020-11-24  |  点击率:790

    精浆柠檬酸定量试剂盒对于判断精子质量有一定的作用。Leagene精浆柠檬酸定量检测试剂盒的测定原理是柠檬酸与吲哚在酸和加热的情况下形成复合物,该复合物通过96孔板测定仪或分光光度计在470nm处测定吸光值,同时做柠檬酸的标准曲线,通过标准曲线来计算精液中柠檬酸的具体含量,即对柠檬酸进行定量检测。

    自备材料:

    1、1.5ml离心管

    2、正向置换型加样器

    3、浓盐酸

    4、水浴锅或恒温箱

    5、96孔板

    6、酶标仪或分光光度计

    精浆柠檬酸定量试剂盒操作步骤(仅供参考):

    1、制备标准曲线:用ddH20稀释Citrate标准(2.24mM)。取离心管加入Citrate标准(2.24mM)和150μl ddH20混合,即获得Citrate标准;取离心管加入Citrate标准(1.12mM)和150μl ddH20混合,即获得浓度为0.56mM的Citrate标准,依次对倍稀释,分别获得浓度为0.28mM和0.14uM的Citrate标准。

    2、制备样本:离心精液样本,取上层精浆置于新的离心管,储存于-20℃待检。

    3、 样本预处理:解冻去除精子的精浆,在混旋器上充分混匀。取若干新的离心管,每管加入ddH20,用正向置换型加样器加入混匀好的精浆,即获得的预处理样本,每个精浆样本应稀释作为复测。

    4、 样本检测:

    ① 脱蛋白:向预处理样本中加入Protein Dilution A和B,混匀。

    ② 离心:室温放置,离心。

    ③ 上样:取上清置转移至离心管中。同时取新离心管加入ddH20作为空白对照,取新的离心管分别加入Citrate标准,即浓度为2.24mM、1.12mM、0.56mM、0.28mM、0.14mM的标准品个2份。

    ④ 显色反应:向每管样本中加入Indole Developer,混匀。向每个样本中加入浓盐酸,封口,在通风橱中充分混匀,50℃水浴中加热,混匀,冰水冷却。

    ⑤ 测OD值:在通风橱中用正向置换型加样器将250μl液体小心移入96孔板中,以ddH20作为空白管调节零点,用酶标仪或96孔读数板在波长下读取结果。

    计算结果:

    ① 做柠檬酸标准曲线,从标准曲线上读取柠檬酸浓度。

    ② 乘以稀释倍数(16倍)得到未稀释精浆中的柠檬酸浓度(mM)。

    ③ 乘以1次精的精液体积,得到每次射出的精液中柠檬酸的含量(μM)。

    ④ 参考值:一次精柠檬酸浓度≥13μM。

    精浆柠檬酸定量试剂盒注意事项:

    1、 建议每次测定时都做标准曲线,以使标准更准确,另外标准品需避免反复冻融。

    2、 如果没有酶标仪,也可以使用普通的分光光度计测定,但应考虑根据比色皿的小检测体积,样品和标准品的用量亦相应按比例放大。使用分光光度计测定蛋白浓度时,每个试剂盒可以测定的样品数量可能会显著减少。

    3、 所测样本的值高于标准曲线的上限,应稀释样本后重新测定。

    4、 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
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