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活体细胞线粒体内膜功能/膜电位红色荧光(TMRM)测定试剂盒

更新时间:2020-09-18  |  点击率:2737

 活体细胞线粒体内膜功能/膜电位红色荧光(TMRM)测定试剂盒产品说明书

(中文版)

 

主要用途

 

 活体细胞线粒体内膜功能/膜电位红色荧光(TMRM)测定试剂是一种旨在通过四甲基罗丹明染料,选择性地聚集在线粒体内呈现荧光染色,其荧光的增强或减弱说明线粒体膜电位的变化,即内膜电负性的增高或降低,来分析线粒体内膜功能的完整性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的其适用于各种线粒体制备物的功能检测。可以被用于细胞凋亡、信号传递、衰老等的研究。产品严格无菌,即到即用,活体检测,操作简易,性能稳定。

 

技术背景

 

四甲基罗丹明(tetramethylrhodamine methyl ester;TMRM),为罗丹明衍生物阳离子染料,作为电势测定(potentiometric)荧光探针:具有亲脂性的,且细胞低毒和光稳定; 第二,与线粒体内负电极结合而聚集;第三,容易进入细胞及其线粒体。四甲基罗丹明进入细胞后,被细胞内酯酶切离,产生四甲基罗丹明四甲基罗丹明进入线粒体后,被线粒体俘获分布和结合在线粒体内膜上,呈现强烈荧光线粒体膜电位的高低变化决定了TMRM的分布浓度。电位高,TMRM在线粒体的浓度高,显强力红色或桔红色;反之,TMRM弥散在胞浆内,荧光减弱表明线粒体膜电位受到损害。 

 

产品内容

 

 染色液(Reagent A)    微升

 稀释液(Reagent B)    毫升

 清理液(Reagent C)    毫升

产品说明书    1

 

保存方式

 

保存 清理液(Reagent C)在4℃冰箱里,其余的保存在-20℃冰箱里; 染色液(Reagent A)避免光照;有效保证6月

 

用户自备

 

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液(GMS12024):用于细胞脱离

*细胞培养液(GMS12052):用于细胞脱落收集

1.5毫升离心管:用于活体细胞线粒体染色的容器

微型台式离心机:用于细胞收集的操作

培养箱:用于染色孵育

(共聚焦)荧光显微镜:用于活体细胞线粒体荧光定性分析

比色皿或96孔板:用于荧光定量分析的容器

荧光分光光度仪或荧光酶标仪:用于活体细胞线粒体荧光定量分析

细胞流式仪:用于活体细胞线粒体荧光分析

 

实验步骤

 

实验开始前,将-20冰箱里的试剂盒中的 染色液(Reagent A)置入冰槽里融化, 稀释液(Reagent B)放进37℃恒温水槽里预热。然后移出xx微升 染色液(Reagent A)到新的1.5毫升离心管,加入xx微升 稀释液(Reagent B),混匀后,在冰槽里静置,并标记为 染色工作液,放在暗室里。然后进行下列操作。

 

一、直接法

 

  • 准备1个24孔细胞培养板的待测细胞,每孔铺满率达70%(约105细胞数)
  • 小心抽去细胞培养液
  • 轻轻沿着孔壁加入xx毫升  清理液(Reagent C)到细胞培养孔,覆盖培养孔表面
  • 小心抽去xx毫升  清理液(Reagent C)
  • 加入xx微升含有 染色液(Reagent A)  稀释液(Reagent B) 染色工作液,覆盖培养孔表面
  • 放进37℃细胞培养箱里,孵育20分钟(注意避光)
  • 小心抽去xx微升 染色工作液
  • 小心加入xx微升 清理液(Reagent C)(注意:检测前置于冰槽里
  • 即刻在倒置荧光显微镜下进行观察滤波器激发波长540nm,散发波长580nm )――可见

红色荧光;如果强度显著减弱,表明线粒体膜电位受到破坏

 

二、间接法

 

  • 准备1个12孔细胞培养板的待测细胞,每孔铺满率达70%(约30万细胞数)
  • 小心移出细胞培养液到15毫升锥形离心管(收集悬浮细胞)
  • 加入xx毫升  清理液(Reagent C)到细胞培养孔,覆盖培养孔表面
  • 小心移出xx毫升  清理液(Reagent C)15毫升锥形离心管(收集洗脱细胞)
  • 加入500微升用户自备的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液,铺满整个培养孔表面
  • 置入37培养箱1分种
  • 轻轻抖动培养板,使细胞脱落,然后加入1毫升*细胞培养液
  • 移入15毫升锥形离心管
  • 放进 台式离心机离心5分钟,速度为300g
  • 小心抽去上清液
  • 加入xx微升 清理液(Reagent C)
  • 用200微升枪头上下轻柔抽吸,混匀细胞颗粒群
  • 转入到1.5毫升离心管或细胞流式仪测试管
  • 加入xx微升含有 染色液(Reagent A)  稀释液(Reagent B) 染色工作液
  • 轻度涡旋震荡2秒
  • 放进37℃细胞培养箱里,孵育20分钟(注意避光)
  • 放进 台式微型离心机离心5分钟,速度为300g
  • 小心抽去上清液
  • 加入xx微升 清理液(Reagent C)(注意:检测前置于冰槽里

 

选择一、(共聚焦)荧光显微镜观察 

 

  • 混匀后,移出50微升在载玻片上
  • 即刻进行载玻片压片,在荧光显微镜下进行观察滤波器激发波长540nm,散发波长580nm――可见亮红色荧光;如果强度显著减弱,表明线粒体膜电位受到破坏

 

选择二、细胞流式仪分析

 

  • 混匀后,即刻进行细胞流式仪分析:观察50000个细胞以上

 

激发波长

488nm

匹配荧光染料

藻红蛋白(phycoerythrin;PE)

荧光颜色

红色

散发波长

575

流式仪通道

FL2

荧光增强

膜电位正常

 

选择三、荧光分光光度仪或荧光酶标仪测定

 

  • 混匀后,移出100微升到黑色96孔板里或100微升比色皿里
  • 即刻进行荧光分光光度仪或荧光酶标仪测定(激发波长540nm,散发波长580nm,获得相对荧光单位(RFU):RFU值高表明线粒体膜电位正常

 

注意事项

 

  • 本产品为20次(0.5毫升工作液)操作
  • 操作时,须戴手套
  • 待测细胞建议不要过于饥饿或过度生长
  • 建议细胞染色完成后,即刻进行荧光检测分析
  • 孵育时,避免光照
  • 健康细胞和线粒体呈现红色;死亡或凋亡细胞及损伤线粒体呈现黯淡或无荧光
  • 本公司提供FCCP溶液,作为线粒体膜电位破坏分子,观察荧光显著减弱现象
  • 本公司提供系列线粒体试剂产品

 

质量标准

 

  • 本产品经鉴定性能稳定
  • 本产品经鉴定荧光清晰
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