真菌/酵母细胞膜性囊泡（RSOV和IOV）制备试剂盒

MB10169.3 v.A

  真菌/酵母细胞膜性囊泡（RSOV和IOV）制备试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

  真菌/酵母细胞膜性囊泡（RSOV和IOV）制备试剂是一种旨在通过差速离心技术从真菌/酵母细胞中分离出各种正常外向膜性囊泡（Right-side out；RSOV）和内侧外翻膜性囊泡（In-side out；IOV）组分的*而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。适合于各种野生型或培养真菌/酵母细胞的膜性囊泡的制备。其制备物产量高，可以被用于膜通道、信号传导机制、膜蛋白分布等研究。产品不含污染性蛋白酶，即到即用，性能稳定，分离产量和纯度俱佳。

技术背景

膜性囊泡（membrane vesicle）分成正常外向膜性囊泡（Right-side out；RSOV）和内侧外翻膜性囊泡（In-side out；IOV）。正常外向膜性囊泡是通过去除细胞浆内容物，使之失去细内在的代谢系统，同时保持质膜的原始位相，有利于提供适合的底物，不会受到降解和代谢，建立动力机制，进行转运或摄入研究，例如微粒体组分用于V型ATP酶研究、线粒体组分用于F型ATP酶研究。而内侧外翻膜性囊泡是通过裂解细胞和细胞器后，质膜重新闭合形成内侧面外翻的囊泡状结构，广泛用于原发性转运系统的研究。 

产品内容

  清理液（Reagent A）    毫升

  平衡液（Reagent B）    毫升

  保存液（Reagent C）    毫升

产品说明书 1份

保存方式

保存  保存液（Reagent C）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，有效保证6月

用户自备

50毫升锥形离心管：用于样品操作的容器

15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器

1.5毫升离心管：用于样品操作和保存的容器

4℃超速离心机：用于分离膜性囊泡

DOUNCE匀浆器：用于裂解细胞

实验步骤

一、正常外向膜性囊泡分离（线粒体和微粒体）

• 准备好50毫升新鲜真菌/酵母样品
• 在分光光度仪上测OD600＝1.0（1 OD＝1 X 10⁷细胞/毫升；总量为5 X 10⁸细胞） 
• 转移到预冷的50毫升锥形离心管
• 放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为3000g
• 小心抽去上清液
• 加入适量的xx毫升  清理液（Reagent A），混匀细胞颗粒群
• 放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为3000g
• 小心抽去上清液
• 即刻放入液氮罐过夜
• 次日从液氮罐里取出，即刻（*速度）碾碎细胞成粉末（注意：切莫使细胞冻融）
• 放进一个15毫升锥形离心管
• 加入xx毫升预冷的  平衡液（Reagent B）
• 涡旋震荡5秒，充分混匀
• 即刻放入预冷的DOUNCE匀浆器
• 在冰槽里用研磨棒匀化细胞（约80下）
• 将所有细胞匀浆物移入15毫升锥形离心管
• 放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1000g
• 小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管
• 放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为10000g
• 小心移出上清液到2个新的1.5毫升离心管，同时保留沉淀颗粒
• 加入xx微升  保存液（Reagent C）到沉淀颗粒管――
• 将含有上清液的2个1.5毫升离心管放进4℃超速离心机离心60分钟，速度为100000g
• 小心抽去上清液
• 分别加入xx微升  保存液（Reagent C）――
• 移取10微升进行蛋白质定量测定（注意：建议使用   Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）
• 即刻放进－70℃冰箱里保存

二、内侧外翻膜性囊泡分离（质膜分离）

• 准备好50毫升新鲜真菌/酵母样品
• 在分光光度仪上测OD600＝1.0（1 OD＝1 X 10⁷细胞/毫升；总量为5 X 10⁸细胞） 
• 转移到预冷的50毫升锥形离心管
• 放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为3000g
• 小心抽去上清液
• 加入适量的xx毫升  清理液（Reagent A），混匀细胞颗粒群
• 放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为3000g
• 小心抽去上清液
• 即刻放入液氮罐过夜
• 次日从液氮罐里取出，即刻（*速度）碾碎细胞成粉末（注意：切莫使细胞冻融）
• 放进一个15毫升锥形离心管
• 加入xx毫升预冷的  平衡液（Reagent B）
• 涡旋震荡5秒，充分混匀
• 即刻放入预冷的DOUNCE匀浆器
• 在冰槽里用研磨棒匀化细胞（约80下）
• 将所有细胞匀浆物移入15毫升锥形离心管
• 放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1000g
• 小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管
• 放进4℃台式离心机离心30分钟，速度为10000g
• 小心抽去上清液 
• 加入xx微升  保存液（Reagent C）――
• 连续－70℃至37℃冻融4次―― 
• 移取10微升进行蛋白质定量测定（注意：建议使用   Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）
• 即刻放进－70℃冰箱里保存
• （选择步骤）进行IOV组分纯化（建议使用   IOV膜性囊泡高质纯化试剂盒－GMS10170）

注意事项

• 本产品为20次（50毫升菌液：1克细胞湿重或5 X 10⁸细胞）操作
• 所有操作均须在4℃或以下状态进行
• 建议使用足够的样品量
• 通常5 X 10⁸细胞的微粒体组分含量为50毫克蛋白，线粒体组分含量5毫克蛋白，100毫克质膜

5． 质膜IOV组分为粗提分离产物，其中含有RSOV和未予闭合的质膜不等，如果需要获得95％以上的高纯度的IOV，建议使用   IOV膜性囊泡高质纯化试剂盒－GMS10170

6． 纯化的样品避免反复冻融  

• 本公司提供系列离子膜通道转运功能（transport/uptake）分析试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定分离组分维持正常活性
• 本产品经鉴定不含污染性蛋白酶和核酶