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组织甘油激酶(Glycerol kinase)活性酶连续反应光谱法定量

更新时间:2020-02-17  |  点击率:1550

MB50379.2 v.A

 

 组织甘油激酶Glycerol kinase活性酶连续反应光谱法定量检测试剂盒

产品说明书(中文版)

 

主要用途

 

 组织甘油激酶(Glycerol kinase)活性酶连续反应光谱法定量检测试剂是一种旨在使用甘油激酶、丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶连续循环法反应系统中,伴随的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)氧化后吸光峰值的降低,即采用光谱法测定样品中酶活性的*而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的其适合于各种动物、人体组织裂解悬液样品的甘油激酶的性活性检测。可用于脂类代谢、能量代谢、蛋白组学、病理生理学等研究。产品不含污染性蛋白酶,严格无菌,即到即用,操作简捷,性能稳定,反应优化,检测敏感。

 

技术背景

 

甘油激酶(glycerol kinase;GK;EC2.7.1.30),又称为ATP甘油-3-磷酸转移酶(ATP:glycerol 3-phospho transferase),广泛存在于生物界。甘油激酶催化由ATP提供的磷酸基团,转移到甘油分子上的反应,产生磷酸甘油。哺乳动物中,甘油激酶参与糖和脂类代谢的交接部位的反应;微生物中,甘油激酶帮助利用甘油分子,作为微生物生长所需的碳源。临床上常用于定量检测人体内甘油水平。通常脂肪细胞(adipocyte)缺乏甘油激酶,由甘油三酯降解产生的甘油分子,由血液转运到肝脏后,甘油激酶参与脂类分解(lipolysis)。基于底物甘油分子,在ATP的参与下,受到甘油激酶的磷酸化,进而通过丙酮酸激酶(pyruvate kinase;PK)和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase;LDH)反应系统中,还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotideNADH)转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotideNAD),产生的吸光峰值的变化340nm,来定量分析甘油激酶活性。其反应系统为:

 

glycerol kinase

Glycerol  +  ATP       ADP  +  α-glycerophosphate

 

pyruvate kinase

Phosphoenolpyruvate  +  ADP             pyruvate  +  ATP

         

lactate dehydrogenase

pyruvate  +  NADH             lactate  +  NAD+

  (高吸收峰) (低吸收峰)

 

产品内容

 

 清理液(Reagent A)  60毫升

 裂解液(Reagent B)  10毫升

 缓冲液(Reagent C)  20毫升

 反应液(Reagent D)      2.5毫升

 阴性液(Reagent E)     2毫升

 底物液(Reagent F) 500微升

产品说明书      1份

 

保存方式

 

保存 清理液(Reagent A)在4冰箱里,其余的保存在-20冰箱里,避免反复冻融 反应液(Reagent D),避免光照,有效保证6

 

用户自备

 

1.5毫升离心管:用于样品保存的容器

15毫升锥形离心管:用于样品制备的容器

(微型)台式离心机:用于样品操作

比色皿:用于光谱分析的容器

分光光度仪:用于光谱分析

培养箱:用于孵育反应物

 

实验步骤

 

实验开始前,将-20℃冰箱里的试剂盒中的试剂溶液置入冰槽里融化; 反应液(Reagent D注意避光。然后进行下列操作。

 

  • 样品准备

 

  • 手术取出动物组织,并秤重以确定500毫克组织重量 
  • (选择步骤)放进预冷的15毫升锥形离心管
  • (选择步骤)加入3毫升 清理液(Reagent A)清洗1次
  • 移入到一个液氮冻存管
  • 即刻放进液氮罐过夜
  • 次日从液氮罐里取出,即刻(*速度)用研磨棒碾碎组织成粉末状(注意:切莫使组织冻融
  • 放进一个15毫升锥形离心管
  • 加入预冷的500微升 裂解液(Reagent B) 
  • 转移到预冷的1.5毫升离心管
  • 强力涡旋震荡30秒,充分混匀
  • 置于冰槽里孵育30分钟,期间每10分钟强力涡旋震荡30秒(注意:如需暂时停止,放进-70冰箱里储存备用
  • 放进4微型台式离心机离心5分钟,速度为16000g(或13000RPM,例如eppendorf 5415)
  • 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
  • 移取10微升进行蛋白定量检测(注意:建议使用  Bradford蛋白质浓度定量试剂盒- MB30030.1
  • 即刻放进-70保存或置于冰槽里继续后续操作

 

二、测定准备

 

  • 准备好待测样品,置于冰槽里 
  • 设定好分光光度仪(温度为25℃):波长为340nm,间隔1分钟,读数11次(共10分钟),并置零
  •  缓冲液(Reagent C室温下均衡温度

 

  • 背景对照测定

 

  • 移取780微升 缓冲液(Reagent C到新的比色皿
  • 加入100微升 反应液(Reagent D
  • 加入20微升 底物液(Reagent F
  • 放进25培养箱里孵育3分钟
  • 加入100微升 阴性液(Reagent E
  • 上下倾倒数次,混匀(限定在3秒之内)
  • 即刻放进分光光度仪检测,此为背景空对照:340波长读数0分钟 340波长读数10分钟

 

  • 样品活性测定

 

  • 移取780微升 缓冲液(Reagent C到新的比色皿
  • 加入100微升 反应液(Reagent D
  • 加入20微升 底物液(Reagent F
  • 放进25培养箱里孵育3分钟
  • 加入100微升待测样品(注意:100微克总蛋白
  • 上下倾倒数次,混匀(限定在3秒之内)
  • 即刻放进分光光度仪检测,此为样品活性读数:340波长读数0分钟 340波长读数10分钟

 

  • 计算样品活性

 

【(样品读数-背景读数)X 1(体系容量毫升)X样品稀释倍数】÷0.1(样品容量毫升)X 6.22(毫摩尔吸光系数 X 10(反应时间;分钟)】=单位/毫升÷(样品蛋白浓度)毫克/毫升=单位/毫克

 

单位=微摩尔NADH/分钟

 

  • 酶标板测定

 

  • 96孔酶标板上做好相应标记:背景对照和样品
  • 分别移取195微升 缓冲液(Reagent C到96孔板中的所有孔中
  • 分别加入25微升 反应液(Reagent D
  • 分别加入5微升 底物液(Reagent F
  • 轻轻摇动96孔酶标板
  • 25℃温度下孵育3分钟
  • 分别加入25微升 阴性液(Reagent E待测样品(20微克蛋白)到相应孔中(注意:样品须清澈
  • 轻轻摇动酶标板
  • 即刻放进酶标仪检测:获得吸光读数
  • 活性计算

 

[(样品读数-背景读数)X样品稀释倍数X 0.25体系容量;毫升)]÷[0.025(样品容量毫升)X 6.22(毫摩尔吸光系数)X 0.6光径距离;厘米)X 10反应时间;分钟)]=单位/毫升÷(样品蛋白浓度)毫克/毫升=单位/毫克

 

单位=微摩尔NADH/分钟

 

注意事项

 

  • 本产品为21次操作,包括1次背景对照
  • 操作时,须戴手套
  • 系统操作过程中,背景测定只需1
  • 避免使用磷酸缓冲溶液处理样品
  • 加入样品后3秒内即刻光谱测定
  • 初始反应可能较为迟缓;测定值由高到低变化;测定可以持续10分钟
  • 测定值由高到低变化,即0分钟测定读数高于10分钟测定读数,表明有酶活性
  • 光谱测定后,比色皿须清洗*
  • 建议待测样本蛋白浓度为100微克/100微升;如果样本酶活性过低或过高,则可以增加或降低样本量;注意计算公式的调整(本公司提供  Bradford蛋白质浓度定量试剂盒 MB30030.1)
  • 甘油激酶活性单位定义:在25温度下,pH 8.9条件下,每分钟内能够氧化1微摩尔还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH所需的酶量作为一个活性单位
  • 本公司提供系列激酶类技术产品

 

质量标准

 

  • 本产品经鉴定性能稳定
  • 本产品经鉴定检测准确

 

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