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组织总抗氧化能力(TAC)比色法(DPPH)定量检测试剂盒产品

更新时间:2019-12-12  |  点击率:3486

组织总抗氧化能力(TAC)比色法(DPPH)定量检测试剂盒产品说明书

(中文版)

 

主要用途

 

 组织总抗氧化能力(TAC)比色法(DPPH)定量检测试剂是一种旨在通过有机氮自由基染料DPPH的参与,在抗氧化剂的存在下,通过分光光度仪,观察其峰值下降的变化,来定量检测对应于标准水溶性生育酚Trolox总抗氧化能力,即消除自由基等值浓度的*而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。适用于各种新鲜组织(动物、人体、植物、昆虫等)的总抗氧化能力检测。可以被用于细胞凋亡、衰老、代谢和营养学等的研究产品严格无菌,即到即用,操作简易,性能稳定。

 

技术背景

 

超氧自由基阴离子(superoxide radical;O2-)、过氧化氢(hydrogen peroxide;H2O2)、羟自由基或氢氧基(hydroxyl radical;OH-)、过氧化基(peroxyl radical;ROO-)、氢过氧自由基(hydroperoxyl;HOO)、烷氧自由基(alcoxyl radical)、氮氧基(nitric Oxide;NO-、过氧亚硝基阴离子(peroxynitrite anion;ONOO-次氯酸(hypochlorous acid;HOCl)、半醌自由基(semiquinone radical)、单线态氧气(singlet oxygen)等细胞内活性氧族(Reactive Oxygen Species;ROS)的产生和增多,将导致细胞衰老或凋亡,甚而导致诸如冠心病、风湿性关节炎、肿瘤、退行性病变等各种病理状况。在生物系统内,通过抗氧化酶例如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶等,大分子,例如白蛋白、铜蓝蛋白(ceruloplasmin;CER)、铁蛋白(ferritin)和抗氧化因子,例如生育醇、类胡萝卜素、抗坏血酸、还原性谷胱甘肽和尿酸胆红素(bilirubin)等,产生抗氧化能力,即捕获自由基的能力,达到消除或降低ROS的损害。通过稳定的有机氮自由基染料1,1-二苯基-2-三硝基苯肼1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazylradical;DPPH),受到抗氧化剂的去自由基作用,呈现深紫色转化为黄色的变化,衡量体系中抗氧化剂捕获自由基、消耗抗氧化剂的能力,在分光光度仪(515nm波长)的帮助下,观察其峰值下降的变化,并与标准化抗氧化剂水溶性生育酚Trolox对照。

 

产品内容

 

 清理液(Reagent A)     毫升

 低渗液(Reagent B)     毫升

 缓冲液(Reagent C     毫升

 染色液A(Reagent D1     瓶

 染色液B(Reagent D2     毫升

 标准液(Reagent E     微升

产品说明书     1份

 

保存方式

 

保存 清理液(Reagent A)在4冰箱里,其余的保存在-20冰箱里,有效保证6

 

 

 

用户自备

 

15毫升锥形离心管:用于组织样品操作的容器

2毫升离心管:用于组织样品操作的容器

1.5毫升离心管:用于组织裂解悬液存放的容器

4微型台式离心机:用于样品操作

超声仪:用于破碎组织细胞

200微升1厘米光径比色皿或96孔板:用于比色的容器

分光光度仪或酶标仪:用于比色分析

 

实验步骤

 

  • 样品准备

 

  • 手术取出动物组织,并秤重以确定组织重量200毫克
  • 移入到一个液氮冻存管
  • 即刻放进液氮罐过夜
  • 次日从液氮罐里取出,即刻(*速度)用研磨棒碾碎组织成粉末状(注意:切莫使组织冻融
  • 放进一个15毫升锥形离心管
  • 加入xx毫升4预冷的  清理液(Reagent A)
  • 强力涡旋震荡30秒,充分混匀
  • 转移到4预冷的2毫升离心管
  • 放进4微型台式离心机离心10分钟,速度为400g(或2000RPM,例如eppendorf 5415)
  • 小心抽去上清液
  • 加入xx毫升4预冷的  清理液(Reagent A),混匀
  • 放进4微型台式离心机离心10分钟,速度为400g(或2000RPM,例如eppendorf 5415)
  • 小心抽去上清液
  • 重复实验步骤11至13二次
  • 加入xx微升 低渗液(Reagent B),混匀
  • 置于200瓦超声仪枪头下,离心管在冰槽里
  • 超声功率为100%,猝击10秒,2个循环
  • 放进4微型台式离心机离心10分钟,速度为10000g(或10000RPM,例如eppendorf 5415)
  • 移取上清液到新的4预冷的1.5毫升离心管
  • 移取10微升进行蛋白定量检测(建议使用  Bradford蛋白质浓度定量试剂盒-GMS30030.1)
  • 使用 清理液(Reagent A)调整蛋白浓度为100微克/10微升
  • 置于冰槽里待测

 

二、标准液准备

 

  • 准备好5个1.5毫升离心管,标记为1至5号管
  • 分别加入xx微升 缓冲液(Reagent C2至5号管
  • 移取xx微升 标准液(Reagent E1号管,混匀
  • 小心移取xx微升1号管的 标准液(Reagent E2号管,混匀
  • 小心移取xx微升2号管稀释的 标准液(Reagent E3号管,混匀
  • 小心移取xx微升3号管稀释的 标准液(Reagent E4号管,混匀
  • 15号管放进冰槽里备用,避免光照;标准管浓度见下表

 

管号

 缓冲液(Reagent C

 标准液(Reagent E

测定体系

标准 Trolox浓度

1

0

xx微升

xx微摩尔/升

2

xx微升

xx微升

xx微摩尔/升

3

xx微升

xx微升

xx微摩尔/升

4

xx微升

xx微升

xx微摩尔/升

5

xx微升

0

0

 

  • 样品测读

 

实验开始前,将-20冰箱里的试剂置于室温下融化,移取xx毫升 染色液B(Reagent D2)到1瓶 染色液A(Reagent D1)里,混匀,置于暗室里,标记为 染色工作液避免光照。然后进行下列操作。

 

  • 准备1个96孔板,做好标记:空白对照孔、标准样品孔、待测样品孔
  • 分别移取xx微升 缓冲液(Reagent C到96孔板里的每个孔里
  • 分别加入xx微升 染色工作液 
  • 加入xx微升 缓冲液(Reagent C空白对照孔
  • 加入xx微升上述配制的 标准液(Reagent E到相应标准样品孔里
  • 加入20微升样品(100微克蛋白总量)到待测样品孔里
  • 轻轻摇动96孔板,使其混匀
  • 室温下孵育15分钟
  • 即刻放进酶标仪里测读:515nm波长
  • 分析结果:
    • 构建标准曲线:纵座标(Y轴)为吸光单位(OD515nm);横座标(X轴)为标准Trolox浓度(微摩尔/升)
    • 空白对照孔为大吸光单位(OD515nm)读数
    • 标准样品孔和待测样品孔为实际吸光单位(OD515nm)读数
    • 根据标准曲线获得样品对应Trolox浓度(微摩尔/升)
    • 计算样品实际总抗氧化能力

 

 

注意事项

 

  • 本产品为50次操作,包括标准品
  • 本产品测试范围为10100微摩尔Trolox等值
  • 操作时,须戴手套
  • 样品制备的所有操作均须在4℃状态下进行
  • 用户可以调整标准曲线区间
  • 测试前,样品须新鲜收集
  • 样品须清澈
  • 空白对照孔的吸光读数应为1.0左右为佳
  • 样品读数越低,抗氧化能力越高
  • 可以使用比色皿检测
  • 如果样品抗氧化剂浓度过高或过低, 建议稀释或增加样品容量或浓度
  • 建议待测样本的蛋白浓度为100微克/20微升(本公司提供   Bradford蛋白质浓度定量试剂盒GMS30030.1)
  • 如果测试样品很多,建议使用排枪移液
  • 本公司提供系列抗氧化分析试剂产品

 

质量标准

 

  • 本产品经鉴定性能稳定
  • 本产品经鉴定检测敏感
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