小鼠核酸氧化8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）ELISA分析试剂盒

 小鼠核酸氧化8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）ELISA分析试剂盒产品说明书

（中文版）

主要用途

 小鼠核酸氧化8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）ELISA分析试剂是一种旨在使用单克隆抗8-羟基脱氧鸟苷抗体竞争性结合样品中的8-羟基脱氧鸟苷，进而使用辣根过氧化酶缀合二抗，由生色染料四甲基联苯胺参与反应，呈现黄色产物，即通过酶联免疫吸附反应（ELISA）比色法定量评价DNA损伤水平的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。主要适用于各种小鼠细胞和组织裂解产物，以及体液样品8-羟基脱氧鸟苷的定量分析。广泛用于细胞衰老、细胞凋亡、肿瘤等的研究。产品即到即用，反应敏感，操作简捷，性能稳定，显色清晰。

技术背景

核酸氧化损伤（nucleotide oxidative damage），包括DNA和RNA损伤，是由于环境因子或细胞代谢影响，在逃避细胞防御机制的前提下，所产生的四种损伤之一：氧化、烷化（alkylation）、水解和碱基错配损伤等。而氧化损伤主要通过活性氧族（reactive oxygen species；ROS），包括超氧自由基阴离子（superoxide radical；O2^-）、过氧化氢（hydrogen peroxide；H2O2）、羟自由基或氢氧基（hydroxyl radical；OH^-）、过氧化基（peroxyl radical；ROO^-）、氢过氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO^-）、过氧亚硝基阴离子（peroxynitrite anion；ONOO^-）等的作用，使碱基羟基化和嘌呤环裂开，诱导鸟嘌呤（guanine；G）向胸腺嘧啶（thymine；T）的颠换（transversion），造成体细胞基因突变，影响细胞周期、基因转录、细胞凋亡等，终导致各种疾病的发生，例如糖尿病、高血压、中风、癌症、衰老等。其中核酸损伤产物8-羟基脱氧鸟苷（8-hydroxy-2’-deoxyguanosine；8-OHdG）作为DNA损伤的分子标志；8-羟基鸟苷（8-hydroxyguanosine）作为RNA损伤的分子标志。8-羟基脱氧鸟苷是常见的DNA损伤产物，也是氧化应急的生物标志。通过使用酶联免疫吸附反应（enzyme-linked immunosorbent assay；ELISA），即基于单克隆抗8-羟基脱氧鸟苷抗体竞争性结合样品中的8-羟基脱氧鸟苷，进而使用辣根过氧化酶缀合二抗，由生色染料四甲基联苯胺（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine，TMB）参与反应，呈现黄色产物，在分光光度仪下（450nm波长），定量检测8-羟基脱氧鸟苷的含量。

产品内容

 标记液（Reagent A）         毫升

 酶促液（Reagent B）    毫升

 清理液（Reagent C）    毫升

 底物液A（Reagent D）    毫升

 底物液B（Reagent E）    毫升

 终止液（Reagent F）    毫升

 标准液（Reagent G）    毫升

 抗体酶标板 96孔

产品说明书 1份

保存方式

保存在4℃冰箱里；暂时不用，保存在－20℃冰箱里； 底物液B（Reagent E）易挥发，密闭瓶盖，避免光照； 抗体酶标板，密封干燥保存；有效保证6月

用户自备

1.5毫升离心管：用于工作液配制

培养箱：用于反应孵育

酶标仪：用于比色分析

实验步骤

实验开始前，将－20℃或4℃冰箱里试剂盒中的试剂置于室温下30分钟均衡温度。然后进行下列操作：

• 标准样品管浓度表：

• 标准样品和待测样品测定

• 准备1个 抗体酶标板：标记好空白对照、标准样品、待测样品
• 加入50微升用户自备的无离子水到空白对照孔里
• 分别加入xx微升 标准液G1至G6到对应的标准样品孔里
• 加入50微升待测样品到待测样品孔里
• 加入xx微升 标记液（Reagent A）到待测样品孔里
• 分别加入xx微升 酶促液（Reagent B）到标准样品和待测样品孔里
• 摇动酶标板，充分混匀
• 密封酶标板
• 放进37℃培养箱里孵育60分钟（注意：培养箱保持湿润，避免干化）
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升 清理液（Reagent C）
• 室温下孵育10秒
• 小心抽去清理液（注意：确保没有液体残留）
• 重复实验步骤11至13四次
• 准备1个1.5毫升离心管
• 分别加入等量的 底物液A（Reagent D）和 底物液B（Reagent E），混匀
• 加入xx微升上述配制的 底物工作液到标准样品和待测样品孔里
• 室温下孵育15分钟，避免光照（注意：可见蓝色沉淀）
• 加入xx微升 终止液（Reagent F），混匀（注意：可见蓝色变成黄色）
• 即刻放进酶标仪测读：450nm波长（注意：不宜超过30分钟）
• 构建8羟基脱氧鸟苷标准曲线：纵座标（Y轴）为吸光值（OD）；横坐标（X轴）为8-羟基脱氧鸟苷浓度（纳克/毫升）
• 根据标准曲线获得样品对应8-羟基脱氧鸟苷浓度（纳摩尔/毫升）

注意事项

• 本产品为96次操作量
• 本产品检测敏感度达0.01纳克/毫升
• 操作时，须戴手套
•  抗体酶标板可以拆卸，用户根据实际需求，选择需要的孔板
• 系统操作时，标准样品测定只需一次
• 孵育时，须避免光照
• 加样时确保加入孔底，避免溅出和气泡
• 注意加样时，避免交叉污染，避免污染母液
• 建议使用湿度充分的培养箱
• 用户根据实际用量，配制 底物工作液；须新鲜配制，即刻使用
• 建议染色完成后，即刻进行比色分析
• 本公司提供系列核酸损伤检测试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定检测敏感