组织甘油-3-磷酸脱氢酶-II 活性比色法定量检测试剂盒（中文版）

组织甘油-3-磷酸脱氢酶-II 活性比色法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）
主要用途
组织甘油-3-磷酸脱氢酶-II（Glycerol-3-Phosphate Dehydrogenase-II）活性比色法定量检测试剂是
一种旨在使用合成电子受体染料，通过反应系统测定染料还原后峰值的变化，即采用比色法测算样品中酶
活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适合于各种动物、人体组织裂
解悬液样品的甘油-3-磷酸脱氢酶-II 的性活性检测。可用于脂类代谢、能量代谢等研究。产品不含污染性蛋
白酶，严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，反应优化，检测敏感。
技术背景
甘油-3-磷酸脱氢酶（Glycerol-3-Phosphate Dehydrogenase；GPDH），又称为α-甘油-3-磷酸脱氢酶（α-
glycerol-3-phosphate dehydrogenase；α-GPDH），催化糖酵解通路中产生的磷酸二羟丙酮（Dihydroxyacetone
phosphate）还原为sn-甘油-3-磷酸（sn-glycerol 3-phosphate）反应的酶，存在于在动物、植物、酵母、细菌
中，尤其存在于人体的肌肉组织和脂肪细胞里。其功能在于参与甘油代谢，同时连接糖酵解和磷脂、甘油
三酯代谢通路在一起，完成脂类和细胞壁的合成，以及能量供给、信号传导、分解代谢和呼吸链电子传递
等作用。甘油-3-磷酸脱氢酶分为I型和II型：I型为胞浆型NAD依赖性甘油-3-磷酸脱氢（Cytoplasmic NAD+-
Dependent Glycerol-3-Phosphate Dehydrogenase或GPDH-NAD+ 2-oxidoreductase；EC1.1.1.8），II型为线粒体
型FAD依赖性甘油-3-磷酸脱氢（Mitochondrial FAD-Dependent Glycerol-3-Phosphate Dehydrogenase或acceptor
oxidoreduxtase；EC1.1.99.5）。I型和II型是联合作用的：即I型通过NADH的氧化消耗，由磷酸二羟丙酮，获
得sn-甘油-3-磷酸，后者通过线粒体外膜，进入线粒体，受到II型的重新氧化为磷酸二羟丙酮，回到胞浆里，
同时产生ATP能量。其中II型是呼吸链电子传递的主要脱氢酶之一，在氧化甘油-3-磷酸的同时，还原辅酶黄
素腺嘌呤二核苷酸（Flavin Adenine Dinucleotide；FAD）为还原型黄素腺嘌呤二核苷酸（Reduced Flavin
Adenine Dinucleotide；FADH2），同时传递电子到泛醌（ubiquinone；UQ）分子，终传递到氧分子上。基
于底物甘油-3-磷酸，在辅酶黄素腺嘌呤二核苷酸的存在下，受到甘油-3-磷酸脱氢酶-II的催化，氧化产生磷
酸二羟丙酮，进而通过使用人工电子受体染料二甲基噻唑二苯基四唑嗅蓝（3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-
2,5-diphenyl-tetrazolium bromide；MTT），简称噻唑盐染料，接受来自还原型黄素腺嘌呤二核苷酸的电子，
而被还原，产生吸光峰值（570nm波长）的变化，来测算甘油-3-磷酸脱氢酶II的活性。其反应方式为：
GPDH-II
glycerol-3-phosphate + FAD + 4H+ → Dihydroxyacetone phosphate + FADH2 + 2H+
Oxidized MTT/UQ + FADH2 → Reduced MTT/UQH2 + FAD + 2H＋
产品内容
裂解液（Reagent A） 毫升
强化液（Reagent B） 毫升
缓冲液（Reagent C） 毫升
反应液（Reagent D） 毫升
阴性液（Reagent E） 毫升
2
底物液（Reagent F） 毫升
产品说明书 1份
保存方式
保存在－20℃冰箱里，避免反复冻融；底物液（Reagent F），避免光照，有效保证6 月
用户自备
1.5 毫升离心管：用于样品保存的容器
15 毫升锥形离心管：用于样品制备的容器
（微型）台式离心机：用于样品操作
比色皿：用于比色分析的容器
分光光度仪：用于比色分析
培养箱：用于孵育反应物
实验步骤
实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的试剂溶液置入冰槽里融化；底物液（Reagent F）注
意避光。然后进行下列操作。
一、 样品准备
1． 手术取出动物组织，并秤重以确定100 毫克组织重量
2． 移入到一个液氮冻存管
3． 即刻放进液氮罐过夜
4． 次日从液氮罐里取出，即刻（快速度）用研磨棒碾碎组织成粉末状（注意：切莫使组织冻融）
5． 放进一个15 毫升锥形离心管
6． 加入预冷的X 毫升裂解液（Reagent A）
7． 涡旋震荡5 秒，充分混匀
8． 在冰槽里孵育2 分钟，期间涡旋震荡5 秒一次
9． 加入X 微升预冷的强化液（Reagent B）
10．涡旋震荡5 秒，充分混匀
11．在冰槽里孵育5 分钟，期间涡旋震荡5 秒二次
12．放进4℃超速离心机离心10 分钟，速度为10000g
13．小心抽去上清液
14．加入X 微升缓冲液（Reagent C），混匀线粒体颗粒群
15．移取10 微升进行蛋白定量检测（注意： Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒－
30030.1 ）
16．即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作
二、测定准备
1． 准备好待测样品，置于冰槽里
3
2． 设定好分光光度仪（温度为30℃）：波长为570nm，间隔1 分钟，读数11 次（共10 分钟），并置零
三、 背景对照测定
1． 移取X 微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入X 微升反应液（Reagent D）
3． 加入X 微升底物液（Reagent F）
4． 放进30℃培养箱里孵育5 分钟
5． 加入X 微升阴性液（Reagent E）
6． 上下倾倒数次，混匀（限定在3 秒之内）
7． 即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照：570 波长读数10 分钟 －570 波长读数0 分钟
四、 样品活性测定
1． 移取X 微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入X 微升反应液（Reagent D）
3． 加入X 微升底物液（Reagent F）
4． 放进30℃培养箱里孵育5 分钟
5． 加入X 微升待测样品（注意：100 微克线粒体蛋白）
6． 上下倾倒数次，混匀（限定在3 秒之内）
7． 即刻放进分光光度仪检测，此为样品活性读数：570 波长读数10 分钟 －570 波长读数0 分钟
五、 计算样品活性
【（样品读数－背景读数）X 1（体系容量；毫升）X 样品稀释倍数】÷【0.05（样品容量；毫升）X 17（毫
摩尔吸光系数 X 10（反应时间；分钟）】＝单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克
单位＝微摩尔MTT/分钟
六、 酶标板测定
1． 在96 孔酶标板上做好相应标记：背景对照和样品
2． 分别移取X 微升缓冲液（Reagent C）到96 孔板中的所有孔中
3． 分别加入X 微升反应液（Reagent D）
4． 分别加入X 微升底物液（Reagent F）
5． 轻轻摇动96 孔酶标板
6． 在30℃温度下孵育5 分钟
7． 分别加入X 微升阴性液（Reagent E）或待测样品（50 微克线粒体蛋白）到相应孔中（注
意：样品须清澈）
8． 轻轻摇动酶标板
9． 即刻放进酶标仪检测：获得吸光读数
10．活性计算
[（样品读数－背景读数）X 样品稀释倍数X 0.25（体系容量；毫升）]÷[0.0125（样品容量；毫升）X 17（毫
4
摩尔吸光系数）X 0.6（厘米）X 10（分钟）]＝单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克
单位＝微摩尔MTT/分钟
注意事项
1． 本产品为21 次操作，包括1 次背景对照
2． 操作时，须戴手套
3． 系统操作过程中，背景测定只需1 次
4． 加入样品后3 秒内即刻比色测定
5． 测定值由低到高变化；测定可以持续10 分钟
6． 测定值由低到高变化，即10 分钟测定读数高于0 分钟测定读数，表明有酶活性
7． 比色测定后，比色皿须清洗*
8． 建议待测样本蛋白浓度为100 微克/50 微升；如果样本酶活性过低或过高，则可以增加或降低样本量；
注意计算公式的调整（本公司提供 Bradford蛋 白质浓度定量试剂盒30030.1 ）
9． 甘油-3-磷酸脱氢酶-II 活性单位定义：在30℃温度下，pH 7.4 条件下，每分钟内能够还原1 微摩尔二甲
基噻唑二苯基四唑嗅蓝（MTT）所需的酶量作为一个活性单位
10．本公司提供系列甘油-3-磷酸脱氢酶类技术产品
质量标准
1． 本产品经鉴定性能稳定
2． 本产品经鉴定检测准确