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细胞基质金属蛋白酶13活性荧光定量检测试剂盒产品说明书(中...

更新时间:2018-03-05  |  点击率:1784

细胞基质金属蛋白酶13活性荧光定量检测试剂盒产品说明书(中文版)

 

主要用途

 

 细胞基质金属蛋白酶13(MMP13)活性荧光定量检测试剂是一种旨在通过荧光探MCA供体和DAP/DNP受体双重标记的多肽底物PChaGNvaHA,受到MMP13蛋白酶的水解,解离抑制基团,产生荧光产物,即采用荧光法来测定样品中酶活性而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的其适用于各种细胞裂解萃取液样品(动物、人体)、部分或*纯化酶样品中基质金属蛋白酶13的特异活性定量检测,以及抑制剂和激活剂的筛选。产品严格无菌,即到即用,操作简捷,性能稳定,安全可靠。

 

技术背景

 

基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinasesMMPs是一类结构高度同源的分泌型或膜相关性锌内肽酶的总称,因含有金属(锌、钙)离子而得名。其功能在于分解细胞外基质成分。迄今为止发现的MMPs至少有28种,几乎能降解除多糖以外的全部细胞外基质(extracellular matrix)成分,同时参与胚胎发育、形态形成、胚泡植入(blastocyst)、血管形成、组织再吸收(tissue resorption)、疾病发生,例如关节炎、癌细胞浸入转移等。根据降解的底物不同可将MMPs分为4大类:(1)胶原酶:MMP1MMP8MMP13主要消化Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅶ、Ⅹ型胶原和蛋白多糖;(2)明胶酶(Ⅳ型胶原酶):MMP2MMP9,又称明胶酶AB,主要消化Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型胶原和弹性纤维;(3)基质溶解素:MMP3MMP7MMP16MMP11、MMP12,主要作用于纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、弹力纤维、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ胶原及MMP1MMP8MMP9;(4)膜型金属蛋白酶:MT1-MMPMT2-MMPMT3-MMP,主要作用于明胶、Ⅳ型胶原、MMP2。体内绝大多数细胞并不储备MMPs,当需要MMPs的信号传递到细胞后才临时合成,合成的MMPs以无活性的酶原(proenzyme)形式分泌到细胞外,随后被多种蛋白酶和非蛋白酶水解以及热处理激活,一种激活的MMPs可激活另一种MMPs,形成瀑布效应。基质金属蛋白酶13(MMP13),又称为胶原酶3(collagenase 3),其目标蛋白是胶原蛋白collagen)、明胶蛋白(gelatin)、纤维蛋白溶酶原plasminogen)、聚糖(aggracan)和基质细胞衍生因子CXCL12)等。MMP13与肿瘤和关节炎等发生有关。MMP13酶原型为60kD,而活化型为48kD和更小分子。基于多肽底物PChaGNvaHA两端标记的供体荧光探针7-甲氧基香豆素(7-methoxycourmarin)受到另一个受体基团二硝基苯二氨基异丁酰[N-3-(2,4-dinitrophenyl)-L-α-β-diaminopropionyl;Dap]的抑制而荧光淬灭(quench)。一旦多肽的Gly-Nva键受到MMP13水解,释放出具有强烈荧光的7-甲氧基香豆素多肽片段,据此根据其荧光强度(激发波长330nm,散发波长400nm)的变化,来定量测定基质金属蛋白酶13的特异活性。反应系统为:

 

 

产品内容

 

 清理液(Reagent A) 毫升

 裂解液(Reagent B) 毫升

 缓冲液(Reagent C) 毫升

 底物液(Reagent D) 微升

 标准液(Reagent E)      微升

产品说明书 1份

 

保存方式

 

保存 底物液(Reagent D) 标准液(Reagent E)-20冰箱里,其余的保存在4冰箱里; 底物液(Reagent D)避免光照,有效保证3

 

用户自备

 

1.5毫升离心管:用于标准样品配制和样品保存的容器

15毫升锥形离心管:用于样品操作的容器

细胞刮脱棒:用于脱离贴壁细胞

(微型)台式离心机:用于样品操作

培养箱:用于反应孵育

黑色酶标板:用于荧光分析的容器

荧光酶标仪:用于荧光分析

 

实验步骤

 

实验开始前,将-20℃冰箱里的试剂置入冰槽里融化。然后进行下列操作。

 

一、样品准备

 

  • 准备好25cm2细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞(15 X 106细胞)
  • 小心加入xx毫升 清理液(Reagent A,覆盖生长表面
  • 小心抽去清理液
  • 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞(注意:避免使用胰酶消化
  • 加入xx毫升 清理液(Reagent A,混匀细胞
  • 移入到预冷的15毫升锥形离心管(注意:悬浮细胞从这一步骤开始
  • 放进4℃台式离心机离心5分钟,速度为300g
  • 小心抽去上清液
  • 加入xx微升 裂解液(Reagent B,充分混匀
  • 转移到预冷的1.5毫升离心管
  • 强力涡旋震荡15
  • 置于冰槽里孵育30分钟
  • 放进4℃微型台式离心机离心5分钟,速度为16000g(或13000RPM,例如eppendorf 5415
  • 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
  • 移取10微升进行蛋白定量检测(注意:建议使用  Bradford蛋白质浓度定量试剂盒-GMS30030.1
  • 即刻放进-70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

 

 

 

  • 测定准备

 

  • 准备好待测样品(例如细胞裂解萃取液或纯化酶样品等),置于冰槽里
  • 设定好荧光酶标仪(温度为37℃):激发波长330nm,散发波长400nm间隔5分钟,读数6次(共30分钟)
  •  缓冲液(Reagent C室温下均衡温度

 

  • 标准样品配制

 

  • 准备好51.5毫升离心管,标记为15号管
  • 分别加入xx微升 缓冲液(Reagent C15号管
  • 移取xx微升 标准液(Reagent E1号管,混匀
  • 小心移取xx微升1号管稀释的 标准液(Reagent E2号管,混匀
  • 小心移取xx微升2号管稀释的 标准液(Reagent E3号管,混匀
  • 小心移取xx微升3号管稀释的 标准液(Reagent E4号管,混匀
  • 15号管放进冰槽里备用;标准管浓度见下表

 

管号

 缓冲液(Reagent C

 标准液(Reagent E

标准甲氧基香豆素多肽浓度

1

xx微升

xx微升

xx微摩尔/升

2

xx微升

xx微升1号管

xx微摩尔/升

3

xx微升

xx微升2号管

xx微摩尔/升

4

xx微升

xx微升3号管

xx微摩尔/升

5

xx微升

0

0

 

四、荧光测定

 

  • 96孔酶标板上做好相应标记:标准样品样品活性
  • 分别移取xx微升 缓冲液(Reagent C到相应孔中
  • 分别加入20微升上述配制的标准液或待测样品(20微克纯化酶或100微克细胞裂解萃取液蛋白)(注意:样品须清澈
  • 放进37℃培养箱里孵育10分钟
  • 分别加入xx微升 底物液(Reagent D
  • 轻轻摇动96孔酶标板
  • 即刻放进荧光酶标仪检测:获得相对荧光读数RFU(Relative Fluorescence Unit
  • 构建标准曲线:纵座标(Y轴)为相对荧光单位RFU;横座标(X轴)为标准甲氧基香豆素多肽浓度微摩尔/升
  • 根据标准曲线获得样品活性对应甲氧基香豆素多肽浓度微摩尔/升

 

五、计算样品活性

 

注意事项

 

  • 本产品为25次操作,包括标准液
  • 操作时,须戴手套
  • 系统操作过程中,标准液测定只需1
  • 样品须澄清,至关重要
  • 样品准备要点如下:
    • 样品中避免使用EDTA、EGTA等二价阳离子鳌和剂
    • 样品中避免使用硫醇抑制剂(THIOL INHIBITOR
    • 如果样品中的基质金属蛋白酶活性很低,可以使用活化剂(建议使用 胶原酶潜酶活化剂(APMA)-GMS12197)
  • 如果用户没有特定的滤波器,可以使用激发波长320至340nm之间的任一波长,散发波长390至420nm之间的任一波长
  • 待测样本为酶粗提样品,其蛋白浓度为20微克/20微升;待测样本为总蛋白,其蛋白浓度为100微克/20微升(本公司提供   Bradford蛋白质浓度定量试剂盒GMS30030.1)
  • 如果待测样品浓度过高或过低,可以调整样品浓度
  • 可以使用基质金属蛋白酶13抑制剂CL-82198作为抑制剂对照或阴性对照
  • 基质金属蛋白酶13活性单位浓度定义:在37℃温度下,pH 7.5的情况下,每单位在单位时间内(每分钟)水解1摩尔的多肽底物PChaGNvaHA
  • 本公司提供系列基质金属蛋白酶检测试剂产品

 

质量标准

 

  • 本产品经鉴定性能稳定
  • 本产品经鉴定检测敏感

 

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