细胞基质金属蛋白酶13活性荧光定量检测试剂盒产品说明书（中...

细胞基质金属蛋白酶13活性荧光定量检测试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

 细胞基质金属蛋白酶13（MMP13）活性荧光定量检测试剂是一种旨在通过荧光探针MCA供体和DAP/DNP受体双重标记的多肽底物PChaGNvaHA，受到MMP13蛋白酶的水解，解离抑制基团，产生荧光产物，即采用荧光法来测定样品中酶活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞裂解萃取液样品（动物、人体）、部分或*纯化酶样品中基质金属蛋白酶13的特异活性定量检测，以及抑制剂和激活剂的筛选。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，安全可靠。

技术背景

基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases；MMPs）是一类结构高度同源的分泌型或膜相关性锌内肽酶的总称，因含有金属（锌、钙）离子而得名。其功能在于分解细胞外基质成分。迄今为止发现的MMPs至少有28种，几乎能降解除多糖以外的全部细胞外基质（extracellular matrix）成分，同时参与胚胎发育、形态形成、胚泡植入（blastocyst）、血管形成、组织再吸收（tissue resorption）、疾病发生，例如关节炎、癌细胞浸入转移等。根据降解的底物不同可将MMPs分为4大类：（1）胶原酶：MMP1、MMP8、MMP13主要消化Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅶ、Ⅹ型胶原和蛋白多糖；（2）明胶酶（Ⅳ型胶原酶）：MMP2、MMP9，又称明胶酶A、B，主要消化Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型胶原和弹性纤维；（3）基质溶解素：MMP3、MMP7、MMP16、MMP11、MMP12，主要作用于纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、弹力纤维、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ胶原及MMP1、MMP8、MMP9；（4）膜型金属蛋白酶：MT₁-MMP、MT₂-MMP、MT₃-MMP，主要作用于明胶、Ⅳ型胶原、MMP2。体内绝大多数细胞并不储备MMPs，当需要MMPs的信号传递到细胞后才临时合成，合成的MMPs以无活性的酶原（proenzyme）形式分泌到细胞外，随后被多种蛋白酶和非蛋白酶水解以及热处理激活，一种激活的MMPs可激活另一种MMPs，形成瀑布效应。基质金属蛋白酶13（MMP13），又称为胶原酶3（collagenase 3），其目标蛋白是胶原蛋白（collagen）、明胶蛋白（gelatin）、纤维蛋白溶酶原（plasminogen）、聚糖（aggracan）和基质细胞衍生因子（CXCL12）等。MMP13与肿瘤和关节炎等发生有关。MMP13酶原型为60kD，而活化型为48kD和更小分子。基于多肽底物PChaGNvaHA两端标记的供体荧光探针7-甲氧基香豆素（7-methoxycourmarin）受到另一个受体基团二硝基苯二氨基异丁酰[N-3-（2,4-dinitrophenyl）-L-α-β-diaminopropionyl；Dap]的抑制而荧光淬灭（quench）。一旦多肽的Gly-Nva键受到MMP13水解，释放出具有强烈荧光的7-甲氧基香豆素多肽片段，据此根据其荧光强度（激发波长330nm，散发波长400nm）的变化，来定量测定基质金属蛋白酶13的特异活性。其反应系统为：

产品内容

 清理液（Reagent A） 毫升

 裂解液（Reagent B） 毫升

 缓冲液（Reagent C） 毫升

 底物液（Reagent D） 微升

 标准液（Reagent E）      微升

产品说明书 1份

保存方式

保存 底物液（Reagent D）和 标准液（Reagent E）在-20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里； 底物液（Reagent D）避免光照，有效保证3月

用户自备

1.5毫升离心管：用于标准样品配制和样品保存的容器

15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器

细胞刮脱棒：用于脱离贴壁细胞

（微型）台式离心机：用于样品操作

培养箱：用于反应孵育

黑色酶标板：用于荧光分析的容器

荧光酶标仪：用于荧光分析

实验步骤

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂置入冰槽里融化。然后进行下列操作。

一、样品准备

• 准备好25cm²细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 X 10⁶细胞）
• 小心加入xx毫升 清理液（Reagent A），覆盖生长表面
• 小心抽去清理液
• 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：避免使用胰酶消化）
• 加入xx毫升 清理液（Reagent A），混匀细胞
• 移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）
• 放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升 裂解液（Reagent B），充分混匀
• 转移到预冷的1.5毫升离心管
• 强力涡旋震荡15秒
• 置于冰槽里孵育30分钟
• 放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
• 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用  Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）
• 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

• 测定准备

• 准备好待测样品（例如细胞裂解萃取液或纯化酶样品等），置于冰槽里
• 设定好荧光酶标仪（温度为37℃）：激发波长330nm，散发波长400nm，间隔5分钟，读数6次（共30分钟）
•  缓冲液（Reagent C）室温下均衡温度

• 标准样品配制

• 准备好5个1.5毫升离心管，标记为1至5号管
• 分别加入xx微升 缓冲液（Reagent C）到1至5号管
• 移取xx微升 标准液（Reagent E）到1号管，混匀
• 小心移取xx微升1号管稀释的 标准液（Reagent E）到2号管，混匀
• 小心移取xx微升2号管稀释的 标准液（Reagent E）到3号管，混匀
• 小心移取xx微升3号管稀释的 标准液（Reagent E）到4号管，混匀
• 将1至5号管放进冰槽里备用；标准管浓度见下表

四、荧光测定

• 在96孔酶标板上做好相应标记：标准样品、样品活性
• 分别移取xx微升 缓冲液（Reagent C）到相应孔中
• 分别加入20微升上述配制的标准液或待测样品（20微克纯化酶或100微克细胞裂解萃取液蛋白）（注意：样品须清澈）
• 放进37℃培养箱里孵育10分钟
• 分别加入xx微升 底物液（Reagent D）
• 轻轻摇动96孔酶标板
• 即刻放进荧光酶标仪检测：获得相对荧光读数RFU（Relative Fluorescence Unit）
• 构建标准曲线：纵座标（Y轴）为相对荧光单位RFU；横座标（X轴）为标准甲氧基香豆素多肽浓度（微摩尔/升）
• 根据标准曲线获得样品活性对应甲氧基香豆素多肽浓度（微摩尔/升）

五、计算样品活性

注意事项

• 本产品为25次操作，包括标准液
• 操作时，须戴手套
• 系统操作过程中，标准液测定只需1次
• 样品须澄清，至关重要
• 样品准备要点如下：
  • 样品中避免使用EDTA、EGTA等二价阳离子鳌和剂
  • 样品中避免使用硫醇抑制剂（THIOL INHIBITOR）
  • 如果样品中的基质金属蛋白酶活性很低，可以使用活化剂（建议使用 胶原酶潜酶活化剂（APMA）－GMS12197）
• 如果用户没有特定的滤波器，可以使用激发波长320至340nm之间的任一波长，散发波长390至420nm之间的任一波长
• 待测样本为酶粗提样品，其蛋白浓度为20微克/20微升；待测样本为总蛋白，其蛋白浓度为100微克/20微升（本公司提供   Bradford蛋白质浓度定量试剂盒GMS30030.1）
• 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
• 可以使用基质金属蛋白酶13抑制剂CL-82198作为抑制剂对照或阴性对照
• 基质金属蛋白酶13活性单位浓度定义：在37℃温度下，pH 7.5的情况下，每单位酶在单位时间内（每分钟）水解1纳摩尔的多肽底物PChaGNvaHA
• 本公司提供系列基质金属蛋白酶检测试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定检测敏感