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食物总抗氧化能力(TAC)比色法(FRAP)定量检测试剂盒产品说明书
点击次数:61 发布时间:2017/12/28

食物总抗氧化能力(TAC)比色法(FRAP)定量检测试剂盒产品说明书

(中文版)

 

主要用途

 

 食物总抗氧化能力(TAC)比色法(FRAP)定量检测试剂是一种旨在通过使用三吡啶基三嗪复合物在抗氧化剂的存在下,还原产生蓝色的亚铁产物,通过分光光度仪,观察其峰值下降的变化,来定量检测对应于标准水溶性生育酚Trolox总抗氧化能力,即抑制氧化等值浓度的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。适用于各种新鲜食物总抗氧化能力检测。产品严格无菌,即到即用,操作简易,性能稳定。

 

技术背景

 

超氧自由基阴离子(superoxide radical;O2-)、过氧化氢(hydrogen peroxide;H2O2)、羟自由基或氢氧基(hydroxyl radical;OH-)、过氧化基(peroxyl radical;ROO-)、氢过氧自由基(hydroperoxyl;HOO)、烷氧自由基(alcoxyl radical)、氮氧基(nitric Oxide;NO-、过氧亚硝基阴离子(peroxynitrite anion;ONOO-次氯酸(hypochlorous acid;HOCl)、半醌自由基(semiquinone radical)、单线态氧气(singlet oxygen)等细胞内活性氧族(Reactive Oxygen Species;ROS)的产生和增多,将导致细胞衰老或凋亡,甚而导致诸如冠心病、风湿性关节炎、肿瘤、退行性病变等各种病理状况。在生物系统内,通过抗氧化酶例如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶等,大分子,例如白蛋白、铜蓝蛋白(ceruloplasmin;CER)、铁蛋白(ferritin)和抗氧化因子,例如生育醇、类胡萝卜素、抗坏血酸、还原性谷胱甘肽和尿酸胆红素(bilirubin)等,产生抗氧化能力,即捕获自由基的能力,达到消除或降低ROS的损害。通过正铁还原抗氧化力(ferric reducing antioxidant power;FRAP)检测,即使用氯化铁三吡啶基三嗪2,4,6-tripyridyltriazineTPTZ产生的三吡啶基三嗪复合物(Fe3-TPTZ),受到抗氧化剂作用还原为三吡啶基三嗪亚铁复合物(Fe2-TPTZ),呈现出蓝色,以 衡量体系中消耗抗氧化剂的能力,在分光光度仪(593nm波长)的帮助下,观察其峰值下降的变化,并与标准化抗氧化剂水溶性生育酚Trolox对照。

 

产品内容

 

 清理液(Reagent A)     500毫升

 缓冲液(Reagent B      20毫升

 染色液A(Reagent C       1毫升

 染色液B(Reagent D       1毫

 标准液(Reagent E     200微升

产品说明书   1份

 

保存方式

 

保存 染色液A(Reagent C 染色液B(Reagent D 标准液(Reagent E)在-20冰箱里,其余的保存在4冰箱里; 染色液A(Reagent C具有腐蚀性,注意操作安全;有效保证6

 

用户自备

 

50毫升烧杯:用于样品操作的容器

15毫升锥形离心管:用于样品操作的容器

1.5毫升离心管:用于标准样品配制的容器

4台式离心机:用于样品操作

培养箱:用于孵育反应

200微升1厘米光径比色皿或96孔板:用于比色的容器

分光光度仪或酶标仪:用于比色分析

 

实验步骤

 

  • 样品准备

 

1、固态食品处理

  • 秤取1克固态食品或粉末到50毫升烧杯,杯口封口膜密封
  • 加入8毫升 清理液(Reagent A)
  • 搅拌30分钟,充分混匀
  • 继续加入 清理液(Reagent A)到终容量为10毫升
  • 过滤纸过滤,去除不溶性固体颗粒
  • 封口膜封口备用

 

2、液态食品处理

  • 移取5毫升待测液态食品到15毫升锥形离心管
  • 放进台式离心机离心10分钟,速度为1500g
  • 移取上清液到新的15毫升锥形离心管
  • (选择步骤)可以加入适量的 清理液(Reagent A) 
  • (选择步骤)过滤纸过滤(如果离心处理,样品仍然不清澈)
  • 置于冰槽里备用或放进-20冰箱里保存

 

二、标准液准备

 

  • 准备好5个1.5毫升离心管,标记为1至5号管
  • 移取100微升 标准液(Reagent E到1号管
  • 分别移取50微升 缓冲液(Reagent B到2至5号管
  • 小心移取1号管的 50微升 标准液(Reagent E到2号管,混匀
  • 小心移取50微升2号管稀释的 标准液(Reagent E到3号管,混匀
  • 小心移取50微升3号管稀释的 标准液(Reagent E到4号管,混
  • 将1至5号管放进冰槽里备用,避免光照;标准管浓度见下表

 

管号

 缓冲液(Reagent B

 标准液(Reagent E

测定体系

标准 Trolox浓度

1

0微升

100微升

300微摩尔/升

2

50微升

50微升

150微摩尔/升

3

50微升

50微升

75微摩尔/升

4

50微升

50微升 

37.5微摩尔/升

5

50微升

0

0

 

  • 样品测读

 

  • 准备1个96孔板,做好标记:空白对照孔、标准对照孔、样品孔
  • 分别移取200微升 缓冲液(Reagent B到96孔板里的每个孔里
  • 分别加入20微升 染色液A(Reagent C)
  • 分别加入20微升 染色液B(Reagent D)
  • 加入10微升 缓冲液(Reagent B空白对照孔
  • 加入10微升上述配制的 标准液(Reagent E到相应标准对照孔里
  • 加入10微升细胞裂解样品(100微克蛋白总量)到样品孔里
  • 震动96孔板,使其混匀
  • 37养箱里孵育30分钟
  • 即刻放进酶标仪里测读:593nm波长
  • 分析结果:
    • 构建标准曲线:纵座标(Y轴)为吸光单位(OD593nm);横座标(X轴)为标准Trolox浓度(微摩尔/升)
    • 空白对照孔为最大吸光单位(OD593nm)读数
    • 标准对照孔和样品孔为实际吸光单位(OD593nm)读数
    • 根据标准曲线获得样品对应Trolox浓度(微摩尔/升)
    • 计算样品实际总抗氧化能力

 

【根据标准曲线获得样品对应Trolox浓度(微摩尔/升)X 0.25(体系容量;毫升) X 样品稀释倍数】÷0.01(样品容量;毫升)=(微摩尔/升TROLOX等值)

 

  • 根据下列公式计算测定体系中样品量的总抗氧化能力(实际抑制百分率)

 

【(空白对照孔吸光单位读数-实际吸光单位读数)÷空白对照孔吸光单位读数】X100%

 

  • IC50:50%抑制率所需的样品单位:TROLOX等值或样品蛋白浓度(毫克/毫升)或样品容量(微升)

 

  X(所需样品单位)=(已知样品单位÷实际抑制百分率)X 50%

 

注意事项

 

  • 本产品为50次操作
  • 本产品测试范围为25800微摩尔
  • 操作时,须戴手套
  • 样品制备的所有操作均须在4℃状态下进行
  • 测试前,样品须新鲜收集
  • 样品须清澈
  • 样品避免含有Tris、EDTA和还原剂等
  • 样品读数越低,抗氧化能力越高
  • 样本量不宜超过20微升
  • 可以使用比色皿检测
  • 如果样品抗氧化剂浓度过高或过低, 建议稀释或增加样品浓度
  • 如果测试样品很多,建议使用排枪移液
  • 本公司提供系列抗氧化分析试剂产品

 

质量标准

 

  • 本产品经鉴定性能稳定
  • 本产品经鉴定检测敏感

 

 

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