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细胞β-内酰胺酶报告基因活性比色法定量检测试剂盒产品说明书(中文版)
点击次数:317 发布时间:2017-12-28

细胞β-内酰胺酶报告基因活性比色法定量检测试剂盒产品说明书(中文版)

 

主要用途

 

 细胞β-内酰胺酶报告基因活性比色法定量检测试剂是一种旨在使用化学方法,快速有效地裂解动物细胞,通过高速离心,获得澄清细胞裂解悬液,在β-内酰胺酶反应体系里,以头孢硝噻吩黄色底物,水解所产生的红色产物,呈现吸光峰值的变化,即采用比色法定量测定细胞裂解悬液制备样品中的β-内酰胺酶活性,藉此建立一种简单的定量评价报告基因的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。广泛应用于基因组学、蛋白质组学和其它分子生物学研究。其适用于转基因后活体细胞外源性β-内酰胺酶活性分析。产品即到即用,性能稳定,参数优化,操作简便、比色敏感。

 

技术背景

 

β-内酰胺酶(β-lactamase;EC3.5.2.6)属于细菌酶蛋白家属的成员之一,29KD单体蛋白(monomeric)。大量细菌分泌产生,分布在细菌周边和细菌细胞浆内,通过水酰胺键(amide bond),分解β-内酰胺(β-lactam)的4原子环状结构,由此产生抗菌素抗性,例如青霉素类、头孢菌素类(cephalosporins)、头霉素类(cephamycins)、 碳青霉素烯类(Carbapenems)抗性。β-内酰胺酶功能上分成4大组,结构上分成4大类。β-内酰胺酶催化反应敏感有效,且容易测试。因此β-内酰胺酶成为崭新的报告基因,替代传统的β-半乳糖苷酶报告基因系统,可以在活体细胞内实时监测基因转录、检测蛋白间相互作用、评价基因表达载体转染的效果。基于头孢硝噻吩(Nitrocefin),一种黄色底物,对于所有β-内酰胺酶具有敏感性,在β-内酰胺酶的催化下,水解产生红色产物,通过486nm波长的吸光峰值分析,来定量分析β-内酰胺酶的活性。

 

产品内容

 

 清理液(Reagent A)     120毫升

 裂解液(Reagent B)    10毫升

 缓冲液(Reagent C)    20毫升

 底物液(Reagent D)   200微升

 阴性液(Reagent E)     2毫升

产品说明书     1份

 

保存方式

 

保存 清理液(Reagent A)在4℃冰箱里其余的保存在-20℃冰箱里; 底物液(Reagent D)避免光照;有效保证6月

 

用户自备

 

15毫升锥形离心管:用于样品操作的容器

1.5毫升离心管:用于样品操作和保存的容器

细胞刮脱棒:用于贴壁细胞脱离

(微型)台式离心机:用于样品操作

比色皿或酶标板:用于比色检测的容器

恒温水槽或培养箱:用于反应物孵育

分光光度仪或酶标仪:用于比色分析

 

实验步骤

 

  • 样品准备

 

  • 准备好25cm2细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞(1至5 X 106细胞)
  • 小心加入3毫升 清理液(Reagent A),覆盖生长表面
  • 小心抽去清理液
  • 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞(注意:可以使用胰酶消化
  • 加入3毫升 清理液(Reagent A),混匀细胞
  • 移入到预冷的15毫升锥形离心管(注意:悬浮细胞从这一步骤开始
  • 放进4℃台式离心机离心5分钟,速度为300g
  • 小心抽去上清液
  • 加入500微升 裂解液(Reagent B),充分混匀
  • 转移到预冷的1.5毫升离心管
  • 强力涡旋震荡15秒
  • 置于冰槽里孵育30分钟
  • 放进4℃微型台式离心机离心5分钟,速度为16000g(或13000RPM,例如eppendorf 5415)
  • 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
  • 移取10微升进行蛋白定量检测(注意:建议使用  Bradford蛋白质浓度定量试剂盒-GMS30030.1
  • 即刻放进-70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

 

  • 测定准备

 

  • 开启并设定好分光光度仪(温度为37℃):波长486nm,间隔5分钟,读数3次(共10分钟),并置零
  • 从-20℃冰箱里取出试剂置于冰槽里融化; 底物液(Reagent D)避免光照
  •  缓冲液(Reagent C)室温下均衡温度
  • 检测实验开始前,移取20微升 底物液(Reagent D)到1.5毫升离心管,加入180微升 阴性液(Reagent E),混匀,标记为 反应工作液,置于暗室里备用。

 

  • 背景对照测定

 

  • 移取780微升 缓冲液(Reagent C)到新的比色皿
  • 加入100微升 反应工作液
  • 上下倾倒数次,混匀
  • 在37℃温度下孵育3分钟
  • 加入20微升 阴性液(Reagent E)
  • 上下倾倒数次,混匀(限定在3秒之内)
  • 即刻放进分光光度仪检测,此为背景空对照(10分钟读数-0分钟读数)
  • 样品测定

 

  • 移取780微升 缓冲液(Reagent C)到新的比色皿
  • 加入100微升 反应工作液
  • 上下倾倒数次,混匀
  • 在37℃温度下孵育3分钟
  • 加入20微升待测样品(100微克蛋白)(注意:样品须清澈
  • 上下倾倒数次,混匀(限定在3秒之内)
  • 即刻放进分光光度仪检测,此为样品读数(10分钟读数-0分钟读数)

 

五、计算样品活性

 

[(样品读数-背景读数)X 1(体系容量;毫升)X样品稀释倍数]÷[0.02(样品容量;毫升)X 20.5(毫摩尔吸光系数)X 10(反应时间;分钟)]=单位/毫升÷(样品蛋白浓度)毫克/毫升=单位/毫克

 

单位=微摩尔头孢硝噻吩/分钟

 

  • 酶标板测定

 

  • 在96孔酶标板上做好相应标记:背景对照和样品
  • 分别移取195微升 缓冲液(Reagent C)到96孔板中的所有孔中
  • 分别加入25微升 反应工作液
  • 轻轻摇动96孔酶标板
  • 在37℃温度下孵育3分钟
  • 分别加入5微升 阴性液(Reagent E)待测样品(50微克蛋白)到相应孔中(注意:样品须清澈
  • 轻轻摇动酶标板
  • 即刻放进酶标仪检测:10分钟读数和0分钟读数
  • 活性计算

 

[(样品读数-背景读数)X样品稀释倍数X 0.25(体系容量;毫升)]÷[0.005(样品容量;毫升)X 20.5(毫摩尔吸光系数)X 0.6(光径距离;厘米)X 10(反应时间;分钟)]=单位/毫升÷(样品蛋白浓度)毫克/毫升=单位/毫克

 

单位=微摩尔头孢硝噻吩/分钟

 

注意事项

 

  • 本产品为20次(比色皿)和80次(酶标板)操作
  • 建议使用核内表达的载体代替胞内表达的载体转染或感染细胞或组织
  • 本产品的各项参数达到zui优化
  • 操作时,须戴手套
  •  底物液(Reagent D)避免光照和反复冻融
  • 用户可以根据需求,配制 反应工作液,不宜存放
  • 如果用户样品有限,转染困难,且酶活性过低,建议使用细胞β-内酰胺酶报告基因活性荧光定量检测试剂盒(GMS10093.1)
  • 反应孵育完成后,即刻进行比色测定
  • 测定值由低到高变化;测定持续10分钟
  • 比色测定后,比色皿须清洗彻底
  • 样本测定10分钟读数高于0分钟读数表明具有酶活性
  • 建议待测样本蛋白浓度为100微克/20微升;如果样本酶活性过低或过高, 则可以增加或降低样本量(本公司提供   Bradford蛋白质浓度定量试剂盒-GMS30030.1)
  • 如果待测样品浓度过高或过低,可以调整样品浓度
  • β-内酰胺酶活性单位浓度定义:在37℃温度下,每单位酶在单位时间内(每分钟)水解1微摩尔的头孢硝噻吩
  • 本公司提供系列β-内酰胺酶检测试剂产品

 

质量标准

 

  • 本产品经鉴定性能稳定
  • 本产品经鉴定检测敏感

 

 

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