冰冻切片基质金属蛋白酶-2原位明胶酶谱法荧光染色试剂盒

 冰冻切片基质金属蛋白酶-2原位明胶酶谱法荧光染色试剂盒产品说明书

（中文版）

主要用途

 冰冻切片基质金属蛋白酶-2（MMP-2）原位明胶酶谱法（in situ zymography）荧光染色试剂是一种旨在通过异硫氰酸荧光素标记的明胶作为底物，在特定抑制剂存在的情况下，针对未固定处理的冰冻切片予以染色处理，基质金属蛋白酶-2切离底物产生高度绿色荧光，来定位组织中的基质金属蛋白酶-2活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种冰冻动物组织的基质金属蛋白酶-2的分析。产品即到即用，性能稳定，操作便捷，敏感度高，荧光清晰，重复性好。

技术背景

基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases；MMPs）是一类结构高度同源的分泌型或膜相关性锌内肽酶的总称，因含有金属（锌、钙）离子而得名。迄今为止发现的MMPs至少有28种，几乎能降解除多糖以外的全部细胞外基质（extracellular matrix）成分，同时参与胚胎发育、形态形成、胚泡植入（blastocyst）、血管形成、组织再吸收（tissue resorption）、疾病发生，例如关节炎、癌细胞浸入转移等。根据降解的底物不同可将MMPs分为4大类：（1）胶原酶：MMP1、MMP8、MMP13主要消化Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅶ、Ⅹ型胶原和蛋白多糖；（2）明胶酶（Ⅳ型胶原酶）：MMP2、MMP9，又称明胶酶A、B，主要消化Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型胶原和弹性纤维；（3）基质溶解素：MMP3、MMP7、MMP16、MMP11，主要作用于纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、弹力纤维、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ胶原及MMP1、MMP8、MMP9；（4）膜型金属蛋白酶：MT₁-MMP、MT₂-MMP、MT₃-MMP，主要作用于明胶、Ⅳ型胶原、MMP2。体内绝大多数细胞并不储备MMPs，当需要MMPs的信号传递到细胞后才临时合成，合成的MMPs以无活性的酶原（proenzyme）形式分泌到细胞外，随后被多种蛋白酶和非蛋白酶水解以及热处理激活，一种激活的MMPs可激活另一种MMPs，形成瀑布效应。基质金属蛋白酶-2，又称明胶酶A （gelatinase-A）或IV型胶原酶（type IV collagenase），其前体分子量为72kDa，激活后分子量为62和56 kDa。它在血清或细胞上清中浓度通常为10至200纳克/毫升。它的作用目标是天然和变性胶原蛋白（collagens）、纤维连接蛋白（fibronectin）、弹性纤维蛋白（elastin）、层粘连蛋白-5 （laminin-5）、前体肿瘤坏死因子-α（pro-TNF-α）和神经（蛋白）聚糖（neurocan）。基质金属蛋白酶-2与肿瘤发展与转移、血管形成、动脉粥样硬化等疾病有关。原位明胶酶谱法荧光染色（in-situ fluorescence zymography）技术在于提高基质金属蛋白酶检测的敏感性，使用异硫氰酸荧光素（FITC）标记的明胶作为底物，在基质金属蛋白酶-9特异性抑制剂MERCK44478存在的情况下，经过基质金属蛋白酶-2水解后产生荧光多肽，据此在荧光显微镜下检测基质金属蛋白酶-2的活性和位置。

产品内容

 胶体液（Reagent A） 毫升

 底物液（Reagent B） 微升

产品说明书     1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里， 底物液（Reagent B），严格避免光照，有效保证6月

用户自备

复染液（GMS40049）：用于样品复染

1.5毫升离心管：用于染色工作液配制的容器

盖玻片：用于样品孵育处理

微波炉：用于融化试剂

恒温水槽或培养箱：用于试剂温育或孵育反应物

荧光显微镜：用于样品染色后观察

实验步骤

实验开始前，准备好10张10微米厚的冰冻切片。同时室温下融化预热 染色液（Reagent B），避免光照。然后进行下列操作。

• 将 胶体液（Reagent A）置于微波炉里加热溶化（注意：避免溢出或干枯）
• 小心移取xx微升 胶体液（Reagent A）到1.5毫升离心管
• 放进37℃恒温水槽孵育10分钟
• 同时瞬间37℃预热 染色液（Reagent B）
• 加入xx微升37℃预热的 染色液（Reagent B），混匀
• （选择步骤）加入1微升用户自备的复染液
• 即刻分别加上40微升上述液体到未固定的冰冻切片的样品上
• 盖上盖玻片（注意：避免气泡）
• 放进4℃冰箱里孵育10分钟，或直至胶体凝结，避免光照
• 放进37℃培养箱里孵育60分钟，避免光照
• 即刻在荧光显微镜下观察：激发波长480nm，散发波长530nm――绿色荧光增强，表明基质金属蛋白酶-9活性高

注意事项

• 本产品为20次操作 
• 操作时，须戴手套
• 样品准备要点如下：
  • 冰冻切片须在8至10微米厚，且未予固定处理
  • 样品中避免使用EDTA、EGTA等二价阳离子鳌和剂以及巯基乙醇和DTT等
  • 样品中避免使用硫醇抑制剂（THIOL INHIBITOR）
  • 如果验证样品中基质金属蛋白酶，可以使用EDTA或抑制剂预处理1小时作为对照
• 建议 胶体液（Reagent A）瞬时加热，以防干枯；或采用60℃度恒温水槽加热融化
• 建议使用10微克/毫升碘化丙啶（Propidium Iodide），作为复染染料
• 如果样品活性过低，可以增加孵育时间至24小时
• 注意区分样品的自发荧光
• 染色参考图像如下：绿色荧光为基质金属蛋白酶-2；红色荧光为碘化丙啶复染

• 本公司提供系列基质金属蛋白酶酶谱检测试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定荧光清晰