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冰冻切片基质金属蛋白酶-2原位明胶酶谱法荧光染色试剂盒
点击次数:45 发布时间:2017/12/28

 冰冻切片基质金属蛋白酶-2原位明胶酶谱法荧光染色试剂盒产品说明书

(中文版)

 

主要用途

 

 冰冻切片基质金属蛋白酶-2(MMP-2)原位明胶酶谱法(in situ zymography)荧光染色试剂是一种旨在通过异硫氰酸荧光素标记的明胶作为底物,特定抑制剂存在的情况下,针对未固定处理的冰冻切片予以染色处理,基质金属蛋白酶-2切离底物产生高度绿色荧光,来定位组织中的基质金属蛋白酶-2活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种冰冻动物组织的基质金属蛋白酶-2的分析。产品即到即用,性能稳定,操作便捷,敏感度高,荧光清晰,重复性好。

 

技术背景

 

基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinasesMMPs是一类结构高度同源的分泌型或膜相关性锌内肽酶的总称,因含有金属(锌、钙)离子而得名。迄今为止发现的MMPs至少有28种,几乎能降解除多糖以外的全部细胞外基质(extracellular matrix)成分,同时参与胚胎发育、形态形成、胚泡植入(blastocyst)、血管形成、组织再吸收(tissue resorption)、疾病发生,例如关节炎、癌细胞浸入转移等。根据降解的底物不同可将MMPs分为4大类:(1)胶原酶:MMP1MMP8MMP13主要消化Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅶ、Ⅹ型胶原和蛋白多糖;(2)明胶酶(Ⅳ型胶原酶):MMP2MMP9,又称明胶酶AB,主要消化Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型胶原和弹性纤维;(3)基质溶解素:MMP3MMP7MMP16MMP11,主要作用于纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、弹力纤维、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ胶原及MMP1MMP8MMP9;(4)膜型金属蛋白酶:MT1-MMPMT2-MMPMT3-MMP,主要作用于明胶、Ⅳ型胶原、MMP2。体内绝大多数细胞并不储备MMPs,当需要MMPs的信号传递到细胞后才临时合成,合成的MMPs以无活性的酶原(proenzyme)形式分泌到细胞外,随后被多种蛋白酶和非蛋白酶水解以及热处理激活,一种激活的MMPs可激活另一种MMPs,形成瀑布效应。基质金属蛋白酶-2,又称明胶酶A gelatinase-A)或IV型胶原酶(type IV collagenase),其前体分子量为72kDa,激活后分子量为62和56 kDa。它在血清或细胞上清中浓度通常为10至200纳克/毫升。它的作用目标是天然和变性胶原蛋白(collagens)、纤维连接蛋白(fibronectin)、弹性纤维蛋白(elastin)、层粘连蛋白-5 laminin-5)、前体肿瘤坏死因子pro-TNF-α)和神经(蛋白)聚糖(neurocan基质金属蛋白酶-2与肿瘤发展与转移、血管形成、动脉粥样硬化等疾病有关。原位明胶酶谱法荧光染色(in-situ fluorescence zymography)技术在于提高基质金属蛋白酶检测的敏感性,使用异硫氰酸荧光素FITC)标记的明胶作为底物,基质金属蛋白酶-9特异性抑制剂MERCK44478存在的情况下,经过基质金属蛋白酶-2水解后产生荧光多肽,据此在荧光显微镜下检测基质金属蛋白酶-2的活性和位置。

 

产品内容

 

 胶体液(Reagent A) 毫升

 底物液(Reagent B) 微升

产品说明书     1份

 

保存方式

 

保存-20冰箱里, 底物液(Reagent B),严格避免光照,有效保证6月

用户自备

 

复染液(GMS40049):用于样品复染

1.5毫升离心管:用于染色工作液配制的容器

盖玻片:用于样品孵育处理

微波炉:用于融化试剂

恒温水槽或培养箱:用于试剂温育或孵育反应物

荧光显微镜:用于样品染色后观察

 

实验步骤

 

实验开始前,准备好1010微米厚的冰冻切片。同时室温下融化预热 染色液(Reagent B),避免光照。然后进行下列操作。

 

  •  胶体液(Reagent A置于微波炉里加热溶化(注意:避免溢出或干枯
  • 小心移取xx微升 胶体液(Reagent A1.5毫升离心管
  • 放进37℃恒温水槽孵育10分钟
  • 同时瞬间37℃预热 染色液(Reagent B
  • 加入xx微升37℃预热的 染色液(Reagent B,混匀
  • (选择步骤)加入1微升用户自备的复染液
  • 即刻分别加上40微升上述液体到未固定的冰冻切片的样品上
  • 盖上盖玻片(注意:避免气泡
  • 放进4℃冰箱里孵育10分钟,或直至胶体凝结,避免光照
  • 放进37℃培养箱里孵育60分钟,避免光照
  • 即刻在荧光显微镜下观察:激发波长480nm,散发波长530nm――绿色荧光增强,表明基质金属蛋白酶-9活性

 

注意事项

 

  • 本产品为20次操作 
  • 操作时,须戴手套
  • 样品准备要点如下:
    • 冰冻切片须在810微米厚,且未予固定处理
    • 样品中避免使用EDTA、EGTA等二价阳离子鳌和剂以及巯基乙醇和DTT等
    • 样品中避免使用硫醇抑制剂(THIOL INHIBITOR
    • 如果验证样品中基质金属蛋白酶,可以使用EDTA或抑制剂预处理1小时作为对照
  • 建议 胶体液(Reagent A瞬时加热,以防干枯;或采用60度恒温水槽加热融化
  • 建议使用10微克/毫升碘化丙啶(Propidium Iodide),作为复染染料
  • 如果样品活性过低,可以增加孵育时间至24小时
  • 注意区分样品的自发荧光
  • 染色参考图像如下:绿色荧光为基质金属蛋白酶-2;红色荧光为碘化丙啶复染

 

  • 本公司提供系列基质金属蛋白酶酶谱检测试剂产品

 

质量标准

 

  • 本产品经鉴定性能稳定
  • 本产品经鉴定荧光清晰

 

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