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细胞尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活剂(uPA)活性比色法定量检测试剂盒

更新时间:2017-12-28  |  点击率:1453

细胞尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活剂(uPA)活性比色法定量检测试剂盒

产品说明书(中文版)

 

主要用途

 

 细胞尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活剂(uPA)活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过三肽化合物底物p-ERG-pNA受到尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活剂的水解,释放黄色对硝基苯胺,产生吸光峰值的变化,即采用比色法来测定细胞裂解萃取样品中酶活性而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的其适用于各种细胞裂解萃取液样品(动物、人体等)尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活剂(uPA)的活性检测。产品严格无菌,即到即用,操作简捷,性能稳定。

 

技术背景

 

尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活剂urokinase-type Plasminogen Activator;uPA;EC3.4.21.73),又称为尿激酶(urokinase;UK,属于丝氨酸蛋白酶,存在于血液、细胞外基质和尿液中。尿激酶由411氨基酸构成,分子量为54KD,有3个结构域:丝氨酸蛋白酶结构域、kringle结构域和生长因子结构域。其主要的生理性底物为纤维蛋白溶酶原Plasminogen),即纤维蛋白溶酶(plasmin)的酶原形式(zymogen),切离部位为Cys-Pro-Gly-ArgVal -Val-Gly-Gly-Cys。一旦切离后激活,纤维蛋白溶酶参与细胞蛋白水解过程,包括血栓溶解thrombolysis)和细胞外基质降解等。uPA与组织重构、修复、血管形成(angiogenesis)性疾病和肿瘤扩散有关。uPA的抑制剂是丝氨酸蛋白酶抑制剂serpins),即纤维蛋白溶酶原激活剂抑制剂Plasminogen Activator Inhibitor;PAI)。基于人工合成的肽化合物底物p-EGR-pNA(pyro-Glu-Gly-Arg-p- Nitroaniline焦谷氨酸甘氨氨酰对硝基苯胺)受到尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活剂的水解,释放有色对硝基苯胺,在分光光度仪405nm 波长)下,测定吸光峰值的变化,来定量测定尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活剂的活性。反应系统为:

 

uPA

p-EGR-pNA-HCl                 p-EGR-OH  +   pNA

                                (黄色)

 

产品内容

 

 清理液(Reagent A) 120毫升

 裂解液(Reagent B)  10毫升

 缓冲液(Reagent C)   2毫升

 阴性液(Reagent D)     1毫升

 底物液(Reagent E)   220微升

产品说明书      1份

 

保存方式

 

保存 清理液(Reagent A)在4冰箱里;其余的保存在-20冰箱里; 底物液(Reagent E)避免光照和反复冻融;有效保证6月

用户自备

 

15毫升锥形离心管:用于样品制备的容器

1.5毫升离心管:用于样品制备和储存的容器

细胞刮脱棒:用于细胞脱离

微型台式离心机:用于样品沉淀

培养箱:用于反应物孵育

96孔板或100微升1厘米光径比色皿:用于样品比色测定的容器

酶标仪或分光光度仪:用于样品比色分析

 

实验步骤

 

实验开始前,将-20℃冰箱里的试剂盒中的 底物液(Reagent E)置入冰槽里融化,避免光照。然后进行下列操作。

 

  • 样品制备

 

  • 准备好75cm2细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞(15 X 107细胞)
  • 小心加入3毫升 清理液(Reagent A,覆盖生长表面
  • 小心抽去清理液
  • 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞(注意:可以使用胰酶消化
  • 加入3毫升 清理液(Reagent A,混匀细胞
  • 移入到预冷的15毫升锥形离心管(注意:悬浮细胞从这一步骤开始
  • 放进4℃台式离心机离心5分钟,速度为300g
  • 小心抽去上清液
  • 加入500微升 裂解液(Reagent B,充分混匀
  • 转移到预冷的1.5毫升离心管
  • 强力涡旋震荡15
  • 置于冰槽里孵育30分钟
  • 放进4℃微型台式离心机离心5分钟,速度为16000g(或13000RPM,例如eppendorf 5415
  • 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
  • 移取10微升进行蛋白定量检测(注意:建议使用  Bradford蛋白质浓度定量试剂盒-GMS30030.1
  • 即刻放进-70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

 

  • 测定准备

 

  • 准备好上述制备的待测样品
  • 设定好分光光度仪或酶标仪(温度为37℃):波长405nm,并置零

 

  • 活性测定

 

  • 在96孔板上做好相应标记:背景对照和样品
  • 分别移取85微升 缓冲液(Reagent C)到相应孔
  • 分别加入5微升 阴性液(Reagent D)或上述制备的待测样品(50微克蛋白)到相应孔(注意:样品须清澈
  • 分别加入10微升 底物液(Reagent E)
  • 轻轻摇动96孔板(注意:避免气泡
  • 在37℃温度下孵育60分钟(注意:可见反应孔里呈现肉眼可见的黄色
  • 即刻放进酶标仪检测或转移到100微升比色皿,在分光光度仪里检测
  • 活性计算:

 

  • 酶标仪检测

 

[(样品读数-背景读数)X样品稀释倍数X 0.10(毫升,测定容量)]÷[0.005(样品容量,毫升)X 10.5(毫摩尔吸光系数)X 60(分钟)X 0.6(厘米)]=单位/毫升÷(样品蛋白浓度)毫克/毫升=单位/毫克

 

单位=微摩尔对硝基苯酚/分钟

 

  • 比色皿检测

 

[(样品读数-背景读数)X样品稀释倍数X 0.10(毫升,测定容量)]÷[0.005(样品容量,毫升)X 10.5(毫摩尔吸光系数)X 60(分钟)]=单位/毫升÷(样品蛋白浓度)毫克/毫升=单位/毫克

 

单位=微摩尔对硝基苯酚/分钟

 

注意事项

 

  • 本产品为21次操作,包括背景对照
  • 操作时,须戴手套
  • 系统操作过程中,背景测定只需1次
  • 样品须澄清,且避免反复冻融
  • 测定值由变化;测定可持续60分钟
  • 比色测定后,比色皿须清洗*
  • 样本测定60分钟读数高于0分钟读数表明具有酶活性
  • 建议待测样本蛋白浓度为50微克/5微升;如果样本酶活性过低,则可以延长反应孵育时间至16小时;其次增加样本量本公司提供   Bradford蛋白质浓度定量试剂盒GMS30030.1)
  • 如果待测样品浓度过高或过低,可以调整样品浓度
  • 尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活剂单位活性定义为:在37℃,pH 7..5条件下,每分钟内能够切离1微摩尔肽化合物底物p-ERG-pNA所需的酶量作为一个活性单位
  • 本公司提供系列细胞蛋白酶学检测试剂产品

 

质量标准

 

  • 本产品经鉴定性能稳定
  • 本产品经鉴定检测敏感
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