冰冻切片氧化应激活性氧次氯酸离子荧光测定试剂盒产品说明书（中文版）

MB10135.2 v.A

   冰冻切片氧化应激活性氧次氯酸离子荧光测定试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

   冰冻切片氧化应激活性氧次氯酸离子荧光测定试剂盒是一种旨在通过透膜荧光染色剂氨苯基荧光素，与细胞内次氯酸阴离子的反应，产生绿色荧光，来测定细胞内次氯酸活性氧族的生成和增加的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。适宜于冰冻动物组织的次氯酸阴离子分析。可以被用于细胞凋亡、信号传递、衰老、代谢和营养学等的研究。产品严格无菌，即到即用，操作简易，活体检测，性能稳定。

技术背景

超氧自由基阴离子（superoxide radical；O2^-）、过氧化氢（hydrogen peroxide；H2O2）、羟自由基或氢氧基（hydroxyl radical；OH^-）、过氧化基（peroxyl radical；ROO^-）、氢过氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO^-）、过氧亚硝基阴离子（peroxynitrite anion；ONOO^-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、单线态氧气（singlet oxygen）等细胞内活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的产生和增多，将导致细胞衰老或凋亡。次氯酸阴离子与细胞膜成分反应，氧化质膜上氢硫基团，通过胺和不饱和脂肪酸的氯离子化和破坏铁硫中心，达到干扰细胞功能，包括葡萄糖和氨基酸转运和钾泵能力。氨苯基荧光素（Aminophenyl fluorescein；2-[6-(4’-Amino) phenoxy-3H-xanthen-3-on-9-yl]benzoic acid；APF）是一种*自由通过细胞膜的荧光染色剂，选择性与次氯酸阴离子反应，生成强烈荧光的荧光素（fluorescein），同时在羟苯基荧光素（Hydroxyphenyl fluorescein；2-[6-(4’-Hydroxy) phenoxy-3H-xanthen-3-on-9-yl]benzoic acid；HPF）的对比存在下，排除其它活性氧族的干扰。据此证明组织细胞内次氯酸活性氧族的存在。 

产品内容

   清理液（Reagent A）     20毫升

   染色液（Reagent B）     50微升

   本底液（Reagent C）     50微升

   稀释液（Reagent D）     20毫升

产品说明书 1份

保存方式

保存   染色液（Reagent B）和   本底液（Reagent C）在－20℃冰箱里，严格避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；有效保证6月

用户自备

1.5毫升离心管：用于细胞染色的容器

培养箱：用于反应孵育

（共聚焦）荧光显微镜：用于观察荧光细胞

实验步骤

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的   染色液（Reagent B）和   本底液（Reagent C）置入冰槽里融化，   稀释液（Reagent D）放进37℃恒温水槽里预热。然后移出5微升   染色液（Reagent B）到新的1.5毫升离心管，加入995微升   稀释液（Reagent D），混匀后，标记为   染色工作液，置入暗室里；同时移出5微升   本底液（Reagent C）到新的1.5毫升离心管，加入995微升   稀释液（Reagent D），混匀后，标记为   本底工作液，置入暗室里。然后进行下列操作。

• 准备2片同一切面厚为10微米的未经固着处理的待测冰冻切片：标记为样本和本底
• 置于室温下，分别小心加上500微升预冷的   清理液（Reagent A），铺满整个切片表面
• 分别小心移去切片上的   清理液（Reagent A）
• 小心加上500微升室温预热的   染色工作液到样本切片上，铺满整个切片表面
• 小心加上500微升室温预热的   本底工作液到本底切片上，铺满整个切片表面
• 在37℃湿润培养箱里，孵育30分钟，避免光照（注意：避免液体蒸发）
• 分别小心移去切片上的   染色工作液和   本底工作液
• 分别小心加上500微升   清理液（Reagent A），铺满整个切片表面
• 分别小心移去切片上的   清理液（Reagent A）
• 放上盖玻片或封片
• 即刻在（共聚焦）荧光显微镜下观察：激发波长499nm，散发波长515nm――（样本绿色荧光—本底绿色荧光）增强，表明次氯酸阴离子含量高

注意事项

• 本产品为20次操作
• 建议使用新鲜组织（手术切除后1小时内）制成的冰冻切片
• 操作时，须戴手套
•    染色工作液和   本底工作液，避免光照
• 孵育时，须避免光照
• 建议组织染色完成后，即刻进行荧光定性分析
• 根据细胞类型，同步调整   染色工作液和   本底工作液使用剂量（1：200至1：1000容量比），避免过度染色
• 如果次氯酸阴离子浓度过低，可以延长孵育时间至60分钟
• 激发波长可以选择在485至500nm，散发波长505至550nm之间的任一波长
• 本公司同时提供系列次氯酸活性氧检测试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定荧光清晰