细胞γ分泌酶（γ-SECRETASE）活性荧光共振定量试剂盒

细胞γ分泌酶（γ-SECRETASE）活性荧光共振能量转移法（FRET）定量检测试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

 细胞γ分泌酶（γ-SECRETASE）活性荧光共振能量转移法（FRET）定量检测试剂是一种旨在通过荧光探针NMA供体和DNP受体双重标记的多肽底物，在γ分泌酶的水解作用下，释放出强烈荧光的NMA，而发生荧光峰值的变化，即采用荧光共振能量转移法来测定样品中酶活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞裂解萃取液样品（动物、人体）、部分或*纯化酶样品中γ分泌酶活性的定量检测，以及抑制剂和激活剂的筛选。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，安全可靠。

技术背景

γ分泌酶（γ-SECRETASE；EC3.4.24.81），是一种多亚体蛋白酶复合物（multisubunit protease complex），由4种蛋白组成：早老素蛋白（Presenilin；PS）、呆蛋白（nicastrin）、前咽缺陷蛋白-1（anterior pharynx defective 1；APH1）和早老素增强蛋白2（presenilin enhancer 2）。其为整合性跨膜蛋白，在早期内质网里组装和成熟，后期内质网进行目标蛋白切离。γ分泌酶切离由β分泌酶切离淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein；APP）产生C99和α分泌酶切离的C83片段，前者成为具有神经毒性的40至42氨基酸长的淀粉样β-多肽（amyloid-β peptide；Aβ）， 是阿茨罕默疾病（alzheimer disease；AD）的病理变化（淀粉样斑；amyloid plaque）的主要成分，由此γ分泌酶成为阿茨罕默疾病治疗的抗淀粉样多肽药物靶标。γ分泌酶与NOTCH调节有关。 基于底物多肽Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-Thr-Val（源于淀粉样淀粉样β-多肽前体蛋白序列708-715），通过荧光共振能量转移法（Fluorescence resonance energy transfer；FRET），即传递激发状态的能量由处于较短波长的供体（donor）到覆盖供体波长的受体（acceptor），使得距离依赖性反应的供体的散发光子淬灭（quench），使用2个荧光探针N-甲基氨茴酰NMA（N-Methyl-anthraniloyl）供体和二硝基苯基DNP（2,4-Dinitrophenyl）受体作为FRET对，来标记的γ分泌酶选择性多肽底物的两端，在γ分泌酶的水解作用下，在丙氨酰（alaninyl）和苏氨酰（threoninyl）残基处切离，释放出强烈荧光的NMA，在荧光分光光度仪下（激发波长340-360nm，散发波长440-450nm），来定量测定γ分泌酶的活性。其反应系统为：

产品内容

 清理液（Reagent A） 毫升 裂解液（Reagent B） 毫升 缓冲液（Reagent C） 毫升 底物液（Reagent D） 微升 标准液（Reagent E）      微升

产品说明书    1份

保存方式

保存 清理液（Reagent A）在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里； 底物液（Reagent D）和 标准液（Reagent E）避免光照，有效保证6月

用户自备

γ分泌酶：用于抑制剂筛选

1.5毫升离心管：用于标准样品操作和样品保存的容器

15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器

细胞刮脱棒：用于贴壁细胞脱离

（微型）台式离心机：用于细胞预处理

黑色酶标板：用于反应和比色的容器

荧光酶标仪：用于荧光分析

实验步骤

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂置入冰槽里融化。然后进行下列操作。

一、样品准备

• 准备好25cm²细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 X 10⁶细胞）
• 小心加入xx毫升 清理液（Reagent A），覆盖生长表面
• 小心抽去清理液
• 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：避免使用胰酶消化）
• 加入xx毫升 清理液（Reagent A），混匀细胞
• 移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）
• 放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升 裂解液（Reagent B），充分混匀
• 转移到预冷的1.5毫升离心管
• 强力涡旋震荡15秒
• 置于冰槽里孵育30分钟
• 放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
• 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用  Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）
• 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

• 测定准备

• 准备好待测样品（例如细胞裂解萃取液或纯化酶样品等），置于冰槽里
• 设定好荧光酶标仪（温度为37℃）：激发波长355nm，散发波长440nm，间隔10分钟，读数7次（共60分钟） 
• 准备好5个1.5毫升离心管，标记为1至5号管
• 加入xx微升 缓冲液（Reagent C）到1号管
• 分别加入xx微升 缓冲液（Reagent C）到2至5号管
• 移取xx微升 标准液（Reagent E）到1号管，混匀
• 小心移取xx微升1号管稀释的 标准液（Reagent E）到2号管，混匀
• 小心移取xx微升2号管稀释的 标准液（Reagent E）到3号管，混匀
• 小心移取xx微升3号管稀释的 标准液（Reagent E）到4号管，混匀
• 将1至5号管放进冰槽里备用；标准管浓度见下表

三、荧光测定

（一）活性测定

• 在96孔酶标板上做好相应标记：标准样品和待测样品
• 分别移取xx微升 缓冲液（Reagent C）到相应孔中
• 分别加入xx微升 底物液（Reagent D）
• 分别加入20微升上述配制的标准液或待测样品（20微克纯化酶或100微克细胞裂解萃取液蛋白）（注意：样品须清澈）
• 轻轻摇动96孔酶标板
• 即刻放进荧光酶标仪检测：获得相对荧光读数RFU（Relative Fluorescence Unit）
• 活性计算：

（二）活性抑制测定（抑制剂筛选）

• 在96孔酶标板上做好相应标记：背景、零抑制、*抑制和待测抑制剂样品
• 按下表加入试剂

• 轻轻摇动96孔酶标板
• 在37℃温度下孵育60分钟
• 即刻放进荧光酶标仪检测：获得相对荧光读数RFU（Relative Fluorescence Unit）
• 抑制活性计算：

注意事项

• 本产品为25次操作，包括标准液
• 建议使用膜蛋白样品为佳（推荐使用 细胞可溶性膜蛋白（粗提）制备试剂盒—GMS30039.1
• 操作时，须戴手套
• 系统操作过程中，标准液测定只需1次
• 样品须澄清，至关重要
• 孵育反应完成后即刻进行荧光测定
• 荧光滤波器可以使用激发波长在340-360nm，散发波长440-450nm
• 待测样本为粗提酶样品，其蛋白浓度为20微克/20微升；膜蛋白样品，为50微克/20微升；细胞裂解悬液，为100微克/20微升（本公司提供   Bradford蛋白质浓度定量试剂盒GMS30030.1）
• 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
• 相对荧光读数RFU（Relative Fluorescence Unit）越高，表明酶活性越高
• 用户可以使用γ分泌酶抑制剂L685,458（IC50=17纳摩尔）作为抑制剂对照或阴性对照
• γ分泌酶活性单位浓度定义：在37℃温度下，pH 6.8条件下，每分钟内能够水解释放1纳摩尔荧光产物NMA所需的酶量作为一个活性单位
• 本公司提供系列蛋白酶检测试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定检测敏感